瘦素对猪卵母细胞体外成熟及克隆猪妊娠率的影响

体细胞克隆猪在人类医学、基础科学研究和畜牧业生产方面均具有很大的应用潜力.为了提高体细胞克隆猪的效率,首先比较了两种基础成熟液NCSU-23和TCM199的体外成熟效果,然后在TCM199培养液的基础上,较系统地研究了添加不同浓度的瘦素对猪卵母细胞成熟、孤雌激活胚胎和克隆胚胎的体外发育以及克隆胚胎体内发育的影响.结果表明:成熟液中添加100ng/mL或200ng/mL瘦素对猪卵母细胞的核成熟没有显著影响(P>0.05);对孤雌激活卵裂率和克隆胚胎卵裂率也没有显著影响(P>0.05);但却显著提高了孤雌激活胚胎的囊胚率和囊胚细胞数,并且显著提高了克隆胚胎的囊胚率;当添加量为100ng/mL时,克隆囊胚的细胞数显著升高.另外,研究表明,瘦素很可能具有提高克隆胚胎移植妊娠率和妊娠到期率的作用.     

K~ 和Ca~(2 )对牛体外受精胚胎体外发育的作用

研究观察了在 SOF PVA这一化学成分明确培养系统条件下 ,不同浓度的 K 和 Ca2 对牛体外受精胚胎体外发育的影响 ,以便为今后进一步探讨影响牛早期胚胎体外发育的因素提供实验依据 .实验 1将牛体外受精卵培养分别于含有 0、5 .0、8.3 5和 2 1 .2 m MK 的 SOF PVA培养系统中 ,结果卵裂率分别为 2 0 .0 % a、87.0 % b、80 .8% b和 85 .7% b(ae,P<0 .0 5 ) .实验 2将牛体外受精卵分别培养于含有 0、1 .1 3、1 .71和 3 .0 m MCa2 的 SOF PVA培养系统中 ,结果卵裂率分别为 0 .9% g、86.6% h、80 .9% h 和 92 .0 % h(g相似文献   

瘦素对小鼠体外胚胎发育率及胚胎移植后着床率的影响

观察瘦素对体外受精后胚胎发育和胚胎移植后着床率的影响。采用小鼠卵母细胞体外受精后胚胎培养及胚胎移植的方法研究仅受精时添加的瘦素对受精后体外胚胎发育的影响及胚胎移植后着床率的影响。结果表明：1）仅受精时添加不同浓度的瘦素对受精卵发育至四细胞胚、桑椹胚及囊胚的比率均无显著影响（P〉0.05）。2）添加的瘦素剂量为10ng/mL及50ng/mL时胚胎着床率较高,当添加的瘦素剂量为100ng/mL-500ng/mL胚胎着床率未提高,两组差别有统计学意义（P〈0.05）。一定水平的瘦素可以显著提高小鼠的体外胚胎移植后的着床率,高水平瘦素反而对着床不利。受精后至着床前各期胚胎的发育率与受精当时瘦素浓度无关。     

成纤维细胞和ES细胞在小鼠和兔去核卵母细胞内发育

以昆明白小鼠成纤维细胞和胚胎干（ES）细胞作为供核细胞,以昆明白小鼠和日本大耳白兔的MⅡ期去核卵母细胞作为受体,采用核移植方法,构楚了克隆胚胎．在同种克隆中,以ES细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率明显低于以成纤维细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（24．4％相对于56．9％,P〈0．05）,1．8％的ES细胞克隆胚胎发育到囊胚阶段,而成纤维细胞克隆胚胎没能发育到囊胚阶段;在异种克隆中,以ES细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（89．6％）和囊胚发育率（18．8％）明显高于以成纤维细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（54．2％）和囊胚发育率（4．2％）．     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

体外培养时间和表皮生长因子对牦牛卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

研究在成熟液中添加表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）以及成熟时间对牦牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响,以确立牦牛卵母细胞体外成熟的最佳体系.结果表明,成熟液中添加EGF组的成熟率明显高于未添加组（P＜0.05）,并且牦牛卵母细胞的成熟率随着EGF添加的浓度增加也不断上升;随着体外培养时间的延长,成熟率逐渐增加,培养24 h后成熟率趋于稳定;胚胎体外培养液中添加EGF能显著提高孤雌胚胎的8-细胞和囊胚形成率（P＜0.05）.由此推测：在体外培养22-24 h,且添加40 μg/mL EGF最有利于牦牛卵母细胞体外成熟;胚胎培养液中添加40μg/mLEGF能显著提高牦牛孤雌胚胎的体外发育能力.     

胚胎的培养液平均拥有量和单独或群体培养对牛体外受精胚胎发育的影响

采用化学成分明确的培养系统,研究了胚胎的培养液平均拥有量以及单独或群体培养对牛IVF卵体外发育的影响.将牛体外受精(IVF)卵分别以每100、50和20μl培养液小滴内10枚卵子的形式进行发育培养,三个处理组的囊胚发育率分别为:6.0%、9.4%和14.3%,三者间无显著差异.在此基础上,选择培养效果较好的每枚胚胎2μl的培养液量,分别在20、10、4、2μl小滴内培养10、5、2、1枚胚胎,四个组的囊胚发育率分别为:10.0%、16.4%、10.0%、4.0%,5枚胚胎/10μl小滴处理组的囊胚率显著高于1枚胚胎/2μl处理组(p<0.05).研究结果表明:不同培养液拥有量以及单独或群体培养都可支持部分胚胎发育至囊胚阶段,降低培养液体积和群体培养更有助于牛IVF卵的体外发育.     

牛体外受精胚胎成份明确培养系统的建立

以 SOF为基本培养液 ,分别添加血清、PVA以及同时添加 PVA、肌醇和柠檬酸钠 ,进行牛体外受精卵的发育培养 ,三个处理组的囊胚发育率分别为 :3 2 .6%、1 1 .9%和 1 5 .9% ,血清处理组极显著高于两个 PVA处理组 (p<0 .0 1 ) .在此基础上 ,将受精处理后的卵子去掉卵丘细胞后 ,培养于 SOF PVA 肌醇 柠檬酸钠培养液内 ,以未去掉卵丘细胞的卵子为对照 ,两个处理组的囊胚发育率分别为 1 0 .8%和 2 1 .1 % .二者间没有显著差异 .结果表明没有血清和卵丘细胞的成份明确的培养系统能够支持牛体外受精卵发育至囊胚阶段 .     

牛体外受精胚胎在成份确定培养液内的发育

将牛体外受精胚胎培养于化学成份确定的 SOF+PVA的培养系统内 ,观察了不同PVA浓度对胚胎体外发育的影响 .结果在 1 mg/ml、3mg/ml和 5mg/ml的 PVA浓度条件下 ,囊胚的发育率分别为 2 7.5% a、1 9.1 % a和 4 .3% b( a>b,P<0 .0 1 ) .将体外受精胚胎分别培养于 M1 99+输卵管上皮细胞、SOF+BSA和 SOF+PVA的三种培养系统内 ,囊胚的发育率分别为 2 0 .4 %、2 9.0 %和 2 7.5% ,结果表明本研究确立的化学成份确定的体外培养系统可以用于牛体外受精胚胎的发育培养 .     

牛胚胎体外生产技术的应用研究

利用屠宰牛卵巢抽出的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验，结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００－２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞标准密度培养，其卵裂率和囊胚发育率没有显著变化，体外授精时间可从成熟培养后２２小时延长至２７小时，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化。卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留孵丘细胞再培养４８小时形     

兔胚胎在不同培养液中体外发育的比较

本试验对比兔2细胞胚胎在三种培养液中体外培养144h后的发育状况。三种培养液分别为：加小牛血清的A组M199培养液、加牛白蛋白5片段的B组M199培养液和加胰岛素、转铁蛋白及谷氨酰胺的C组M199培养液。从发育速度看,A组和B组比C组的胚胎发育快;从发育效果看,发育到囊胚和孵化囊胚的比例,A、B、C三组分别为77．0％、64．8％及7．0％。这两方面结果都说明A、B组培养效果接近,C组的培养效果较差。试验结果表明,B组培养液是研究影响兔胚胎发育因素的适宜培养液。     

小鼠四倍体半克隆胚胎发育研究

半克隆(Semi-Cloned)胚胎是通过注射体细胞核到未去核的卵母细胞中产生的。在半克隆胚胎中,体细胞被用来作为精子的替代物。然而,由于异常的染色体分离,构建的半克隆胚胎在激活后形成了非整倍体而导致胚胎发育受到严重影响,不能发育到期。本研究通过抑制小鼠半克隆胚胎在激活过程中染色体数目减半,避免非整倍体胚胎形成,研究四倍体半克隆(TetraploidSemi-cloned,TSC)胚胎的发育和体细胞核的掺入对胚胎发育的影响。结果显示,TSC胚胎的体外发育率显著高于二倍体半克隆胚胎,与正常受精卵及孤雌激活对照无显著性差异,但TSC胚胎的细胞数在桑椹胚和囊胚期比正常二倍体受精胚胎和孤雌激活胚胎少。通过Oct-4染色发现,TSC胚胎囊胚期内细胞团(InnerCellMass,ICM)细胞很少或者没有。移植63个四倍体半克隆胚胎到3只假孕母鼠体内,得到20个胎盘,但没有得到胎儿。组蛋白乙酰化和DNA甲基化检测显示,部分TSC胚胎在囊胚期没有形成正常受精胚胎在ICM和滋养外胚层(Trophectoderm,TE)之间的差异分布。TSC胚胎的基因表达不依赖于细胞分裂次数而依赖于发育时间。虽然TSC胚胎避免了二倍体半克隆胚胎形成非整倍体现象,但由于TSC胚胎没有ICM细胞或ICM细胞很少,所以只能形成胎盘而不能形成胎儿。本实验第一次较为全面地研究了TSC胚胎的发育,同时也为研究体细胞核再程序化、基因打靶技术提供了一种新的途径。     

Effects of different nuclear recipients on developmental potential of mouse somatic nuclear transfer embryos

Somatic cell nuclear transfer has been succeeded in procedures of nuclear transfer. One is single nucleartransfer, the other is serial nuclear transfer. Viable animals have been cloned in different species using both me-thods[1—6]. Different nuclear recipients and donors wereused in serial nuclear transfer, namely, transferring thenuclear of reconstructed embryo into enucleated MⅡoocytes[7], transferring the nuclear of reconstructed em-bryos at one cell stage into enucleated zygote[4] and t…     

Clone of Chinese Jinan red-cross yellow cattle and evaluation of reproductive characteristics of cloned calf

Somatic cell clone technology is a viable approach to preserving endangered livestock and wildlife genetic resources. In the present research, somatic cell nuclear transfer （SCNT） was performed using granulose cells from the critical endangered Chinese red-cross yellow cattle as donor cells. A total of 211 oocytes were manipulated and 166 （79%） of them were successfully enucleated. 112 （67.4%） SCNT embryos were reconstructed, 94 （83%） of them cleaved, and 48 （43 %） of them developed to blastocyst stage. SCNT blastocysts were transferred to 6 Holstein recipients, and 2 （33%） of them were found to be pregnant. One of them maintained to term and delivered a calf, whereas another aborted. Effect of different fusion buffer （mannitol vs. Zimmerman fusion buffer） and different activation methods （calcium ionophore＋6-DMAP vs. cycloheximide＋CB） on fusion rate and development of SCNT embryos were investigated. The results indicated that： （i） on condition of two DC pulses of 2.5 kV/cm for 10 μs each, fusion rates were higher in mannitol solution than in Zimmerman fusion buffer （71% vs. 61%, respectively, p 〈 0.05）, but the blastocysts rates did not differ between two treatments （36 % vs. 39 %, p〉0.05 ）; （ii） There was no significant difference in development rates to the blastocyst stage for SCNT embryos activated by calcium ionophore＋6-DMAP or by cycloheximide＋CB （42% vs. 46%, respectively, p〉0.05）. Microsatellite DNA analysis examining 28 loci confirmed that the cloned calf was genetically identical to the donor Jinan red-cross yellow cattle and different from the recipient females. Growth and reproductive performance of cloned cow were evaluated, and there were no difference i cross-red n it between cloned and normal control Jinan yellow cattle. Furthermore, the cloned yellow cow has delivered a healthy yellow calf.     

不同体外培养系统对牛体外受精胚胎冷冻解冻后孵化能力的影响

采用ＳＯＦ和ＴＣＭ１９９与输卵管上皮细胞共同培养系统对牛体外受精卵进行培养,观察了在这两种培养条件下得到的囊胚经冷冻—解冻后的孵化能力．在ＳＯＦ＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２１．３％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为３７．５％;在ＴＣＭ１９９＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２６．０％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为４７．７％．研究结果表明这两种体外培养系统的培养效果无显著差异（Ｐ＞０．０５）．