猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型,试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。先采用机械分离方法分离子宫平滑肌,再用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法消化,可获得90%以上具有正常代谢活性的小鼠子宫平滑肌细胞,存活的细胞经倒置显微镜观察和免疫荧光染色进行鉴定。原代培养3d后细胞贴壁生长,约2周后细胞汇合成片,所培养的细胞在倒置显微镜下呈梭形和典型"峰-谷"样生长,平滑肌细胞肌动蛋白(α-Actin)免疫荧光染色强阳性。采用本法体外培养的小鼠子宫平滑肌细胞生长良好,纯度高,可用于小鼠子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的研究。     

CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞可行性分析

采用荧光染料CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞(SPC),评价其生物可行性.分离和培养SPC,采用CMDiI进行标记,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测标记效果和传代后的细胞标记率.同时,进行细胞爬片培养后免疫荧光染色,观察标记后细胞表达平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙调节蛋白(Calponin)和增殖细胞核抗原(PCNA)的情况.进行台盼蓝排斥实验、细胞粘附实验、细胞增殖实验和细胞迁移实验,观察标记后的SPC存活率以及粘附、增殖和迁移能力的变化.结果发现,培养4d左右可见SPC开始生长,一周后出现SPC克隆.通过免疫荧光和流式细胞术分析,CM-DiI标记率为96%左右,连续传代2周后标记率仍在40%以上.标记后的细胞可表达α-SMA、Calponin和PCNA.同时发现,标记后的细胞存活率无明显降低,细胞粘附能力、增殖能力和迁移能力无明显改变.本研究证明采用CM-DiI标记SPC操作简便,效果好,不改变细胞表型,不影响细胞的存活率和粘附、增殖及迁移能力,可作为SPC的荧光示踪剂.     

同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞和内皮祖细胞

同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞(SPC)和内皮祖细胞(EPC),为组织工程膀胱的构建和血管化提供种子细胞.分离新西兰兔外周血中的单个核细胞,分别进行SPC和EPC的分离和培养;同时,培养兔膀胱平滑肌细胞(BSMC)作为对照.细胞爬片,观察细胞摄取Dil-AcLDL和结合FITC-UEA-1的能力;间接免疫荧光染色观察平滑肌肌动蛋白(SMA)、结蛋白(Desmin)、KDR、eNOS和vWF的表达情况;进行细胞增殖实验,观察PDGF-BB,VEGF对SPC和EPC的增殖作用.结果发现,培养1周后出现SPC克隆和EPC克隆,SPC呈梭形,长短不一;EPC形态均一,呈典型的鹅卵石形;培养的BSMC形态均一,为长梭形,呈峰谷样形态.利用克隆环分离SPC和EPC克隆,继续培养可得到高纯度的SPC和EPC.SPC不摄取Dil-AcLDL,不结合FITC-UEA-1;SPC表达SMA、Desmin和KDR,不表达eNOS和vWF.EPC同时摄取Dil-AcLDL和结合FITC-UEA-1;EPC表达eNOS、vWF和KDR,不表达SMA和Desmin.BSMC仅表达SMA和Desmin.PDGF-BB仅能促进SPC增殖...     

树鼩小肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定

目的从树鼩小肠分离小肠上皮细胞,探索分离培养方法和条件,为药物开发和病原感染机制研究提供体外细胞模型,并且为建立树鼩小肠上皮细胞系奠定基础。方法采用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ及DTT联合消化树鼩小肠组织块,得到的细胞经完全培养液培养,用相差显微镜观察细胞形态,通过MTT法测定细胞生长曲线,并采用细胞角蛋白荧光染色等方法鉴定细胞。结果经优化分离法得到的肠上皮隐窝细胞团在24 h后贴壁,6 d汇合成片,在显微镜下观察发现细胞团延辐射状向外长出铺路石样和多角状的细胞;第二代后,每隔2~3 d可传代1次;细胞接种3~6 d为对数生长期;细胞角蛋白18进行免疫荧光鉴定后确定为小肠上皮细胞。结论本实验成功地从树鼩小肠分离到了小肠上皮细胞,并且建立了树鼩小肠上皮细胞体外培养的方法。     

兔骨髓基质细胞的分离培养研究

目的分离培养兔骨髓基质细胞,观察其体外生长特性.方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离兔骨髓基质细胞,进行体外培养,传代扩增,测定其生长曲线,用相差显微镜、细胞化学染色观察细胞生物学性状及功能特点.结果密度梯度离心结合贴壁培养法可有效分离并且纯化兔的骨髓基质细胞.传代细胞均一性较好,呈纺锤形,细胞增殖快,加入地塞米松(Dxm 10-5 mmol/L),β-甘油磷酸钠(β-GP 2 mmol/L)、L-抗坏血酸(AA 50 mg/L)可诱导BMSCs分化为成骨细胞,von kossa法检测骨钙素阳性.结论体外培养的骨髓基质细胞生长稳定,增殖力强,可诱导分化.     

大鼠半月板纤维软骨细胞的分离、培养与鉴定

探讨体外大鼠半月板纤维软骨细胞分离培养与鉴定的实验方法,观察不同代次间细胞的形态学特征.手术分离大鼠双膝内外侧半月板,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶消化法提取细胞,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定细胞,低糖DMEM完全培养液常规培养.结果表明,原代半月板细胞形态呈多角形,轮廓清晰,8～10d可铺满瓶底;传代后的1～3代细胞,其贴壁及增殖能力加强,生长状态良好;传至4～5代尤其是第5代之后,细胞表型不稳定,密度稀疏,形态以长梭形为主且不规则,清晰度下降,传代周期延长;细胞鉴定结果呈阳性.双酶消化和低糖DMEM完全培养液常规培养可以获得具有良好生物学特性的半月板细胞,第4代之前的半月板细胞可以为运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.     

外周血内皮祖细胞在去细胞猪主动脉瓣膜上种植的体外观察

为在体外观察外周血内皮祖细胞种植到去细胞猪主动脉瓣上的生长情况.采用TritonX-100联合胰蛋白酶、核酸酶去除猪主动脉瓣膜细胞.从志愿者外周血中分离培养内皮祖细胞,免疫荧光鉴定细胞后.将从外周血培养的EPC种植到去细胞猪主动脉瓣膜上,用HE、免疫组化染色和免疫荧光染色观察种植效果.结果显示猪主动脉瓣内的细胞去除彻底,但纤维支架保存良好.人外周血培养出的细胞,免疫荧光染色示ac-LDL和UEA-1阳性,提示为内皮祖细胞,种植后行HE染色可见到去细胞猪主动脉瓣膜表面单层内皮细胞生长,并且表达von Willebrand因子和CD31.     

豚鼠气管平滑肌细胞培养

目的 建立一种简便、快捷的豚鼠气管平滑肌细胞培养方法。方法 幼年豚鼠气管平滑肌组织块原代培养 法。结果 豚鼠气管平滑肌组织块贴壁5～8d后可见细胞自组织块周围长出,细胞长梭形,核位于中央,呈辐射状 向四周生长。两周后细胞长满瓶壁。经α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(α-smooth muscle actin monoclonal antibody, α-SMA)免疫组化染色鉴定,获得的细胞为平滑肌细胞。结论 豚鼠气管平滑肌组织块培养法可快速获得数量充足 的气管平滑肌细胞。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离与体外培养

研究了昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离、培养和生长特征,建立了快速、稳定的优质饲养层细胞培养体系.从不同日龄的胎鼠均分离到胚胎成纤维细胞,但最佳分离时间为13.5~14.5d;三种分离原代胚胎成纤维细胞的方法中胰酶消化法效果最好,能在较短的周期内获得大量原代及传代细胞;MEF细胞形态以小梭形为主,呈漩涡状、火焰状生长;增殖速度较快,每1~2d可传一代,按1∶3比例常规传代;5代以内适宜制作饲养层用,5代以后细胞开始变形呈现典型的衰老特征.     

H2O2致猪冠状动脉平滑肌的内皮源性超极化作用

目的探讨过氧化氢（H2O2）致猪冠状动脉内皮源性超极化作用。方法采用标准微电极技术观察H2O2对猪冠状动脉平滑肌细胞膜电位的作用以及过氧化氢酶对上述作用的影响。结果直接加入外源性H2O2可引起去除内皮后猪冠状动脉平滑肌的产生浓度依赖性超极化作用,过氧化氢酶可拮抗H2O2的超极化作用。结论H2O2可引起平滑肌细胞的内皮源性超极化作用,具有类似EDHF的作用。     

不同氧浓度对裸鼹鼠原代鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响

摘要: 目的建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养方法,观察不同氧浓度对裸鼹鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响,寻找最适宜体外裸鼹鼠细胞增殖和生长的氧浓度。方法利用机械法辅以化学法分离新生裸鼹鼠脑内胶质细胞,利用差速贴壁法进行星形胶质细胞纯化,通过设置3%、5%、10%以及20%等不同氧浓度环境,利用CCK8 染色法分析不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞增殖速率,利用免疫细胞化学染色法观察不同氧浓度下裸鼹鼠细胞胞体伸长突起的状况从而进一步判断不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞生长状态。结果利用机械及化学法分离裸鼹鼠胶质细胞并结合差速贴壁法能够成功建立体外裸鼹鼠星形胶质细胞模型。不同氧浓度环境下裸鼹鼠生长速率不同,随着氧浓度的升高,裸鼹鼠进入快速生长期所用的时间越短。氧浓度为20%时,裸鼹鼠星形胶质细胞较小,突起少,状态不佳,但是10%以下的氧浓度环境中,裸鼹鼠能保持较多的细胞突起,状态较好。结论机械及化学法相结合,合并差速贴壁法能够成功建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养模型, 10% 氧浓度下既可以保证裸鼹鼠星形胶质细胞适宜的生长速率又能保证其处于良好的生长状态。     

乌龟脑和肝组织细胞的体外培养

以乌龟脑和肝组织为材料,用φ=20%胎牛血清的DMEM培养液进行体外培养,同时也对肾、心肌、脾脏、尾部肌肉等组织进行了体外培养,结果表明:原代培养的脑细胞(TBCs)和肝细胞(TLCs)生长良好,传代TBCs前3代生长稳定,第4代出现聚集生长,第5代出现"自发转化"现象,至12代,"转化"后的细胞体系生长旺盛;TLCs传代后不易增殖,第3代出现衰退;肾脏细胞在培养过程中有少量贴壁;心肌、脾脏、尾部肌肉的细胞培养都不成功。     

Cytochrome P450 2C is an EDHF synthase in coronary arteries.

In most arterial beds a significant endothelium-dependent dilation to various stimuli persists even after inhibition of nitric oxide synthase and cyclo-oxygenase. This dilator response is preceded by an endothelium-dependent hyperpolarization of vascular smooth muscle cells, which is sensitive to a combination of the calcium-dependent potassium-channel inhibitors charybdotoxin and apamin, and is assumed to be mediated by an unidentified endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF). Here we show that the induction of cytochrome P450 (CYP) 2C8/34 in native porcine coronary artery endothelial cells by beta-naphthoflavone enhances the formation of 11,12-epoxyeicosatrienoic acid, as well as EDHF-mediated hyperpolarization and relaxation. Transfection of coronary arteries with CYP 2C8/34 antisense oligonucleotides results in decreased levels of CYP 2C and attenuates EDHF-mediated vascular responses. Thus, a CYP-epoxygenase product is an essential component of EDHF-mediated relaxation in the porcine coronary artery, and CYP 2C8/34 fulfils the criteria for the coronary EDHF synthase.     

Dynamic measurement of myosin light-chain-domain tilt and twist in muscle contraction.

A new method is described for measuring motions of protein domains in their native environment on the physiological timescale. Pairs of cysteines are introduced into the domain at sites chosen from its static structure and are crosslinked by a bifunctional rhodamine. Domain orientation in a reconstituted macromolecular complex is determined by combining fluorescence polarization data from a small number of such labelled cysteine pairs. This approach bridges the gap between in vitro studies of protein structure and cellular studies of protein function and is used here to measure the tilt and twist of the myosin light-chain domain with respect to actin filaments in single muscle cells. The results reveal the structural basis for the lever-arm action of the light-chain domain of the myosin motor during force generation in muscle.     

小鼠精原干细胞的体外培养与鉴定

建立一种简单、有效体外分离和培养精原干细胞（Spermatogonia stem cell,SSCs）的方法。采用酶消化6—8d新生小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液后进行培养,碱性磷酸酶（AKP）染色和间接免疫荧光对培养的细胞进行鉴定;结果显示：SSCs培养3～5天可观察到细胞克隆的产生,AKP染色强阳性;间接免疫荧光显示GCNF阴性,oct-4、c—kit均呈阳性反应。由此可知以DMEM＋15％胎牛血清＋白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）＋L-谷氨酰胺等为培养基,成功建立了精原干细胞的体外培养体系。     

Alteration in crossbridge kinetics caused by mutations in actin

The generation of force during muscle contraction results from the interaction of myosin and actin. The kinetics of this force generation vary between different muscle types and within the same muscle type in different species. Most attention has focused on the role of myosin isoforms in determining these differences. The role of actin isoforms has received little attention, largely because of the lack of a suitable cell type in which the myosin isoform remains constant yet the actin isoforms vary. An alternative approach would be to examine the effect of actin mutations, however, most of these cause such gross disruption of muscle structure that mechanical measurements are impossible. We have now identified two actin mutations which, despite involving conserved amino acids, can assemble into virtually normal myofibrils. These amino-acid changes in actin significantly affect the kinetics of force generation by muscle fibres. One of the mutations is not in the putative myosin-binding site, demonstrating the importance of long-range effects of amino acids on actin function.     

树鼩胸主动脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的 体外分离、培养树鼩(Tupaia belangeri)胸主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs),并对培养细胞进行初步鉴定, 为新型实验动物树鼩的应用研究提供体外模型。方法 无菌取幼龄树鼩胸主动脉,采用组织块培养法和胰蛋白酶、胶原酶连续消化法分别进行树鼩胸主动脉血管内皮细胞分离,经完全培养液培养,倒置显微镜观察细胞形态,并用抗Ⅷ因子抗体进行荧光染色鉴定细胞。结果 经组织块培养法分离培养的血管内皮细胞,3 d有细胞贴壁,7 d后细胞从组织块中大量长出,15 d汇合为单层;酶消化法所得细胞12 h即贴壁,3～7 d生长较快,12 d汇合成单层,镜下观察发现细胞呈典型的铺路石状;两种方法分离所得原代细胞经体外培养传代,6代内,细胞生长均良好;利用血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子进行免疫荧光鉴定后确定为阳性。结论 本研究采用简便的方法成功分离到了树鼩胸主动脉血管内皮细胞,为血管内皮细胞相关研究提供了实验模型。