类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELP-mCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELP-mCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果 DNA测序结果 显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果 表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100％.结论 成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.     

基于小热休克蛋白-细胞穿膜肽蛋白纳米粒的siRNA递送系统

利用大肠杆菌表达系统原核表达并纯化小热休克蛋白-细胞穿膜肽融合蛋白（Hsp-Tat）; 用动态光散射和透射电镜成像分析Hsp-Tat纳米粒的粒径和形貌; 用噻唑蓝（MTT）法和活/死细胞染色法研究蛋白纳米粒的细胞相容性; 用凝胶阻滞实验检测纳米粒的小干扰RNA（siRNA）复合特性; 用激光共聚焦荧光显微镜成像研究蛋白纳米粒的siRNA胞内递送能力. 实验结果表明： 亲和层析得到高纯度的Hsp-Tat融合蛋白, 融合蛋白可自组装成40.2 nm空心球形结构; 蛋白纳米粒在HEK-293T细胞上显示出良好的细胞相容性; Hsp-Tat NP与siRNA形成的复合物可阻止siRNA在琼脂糖凝胶中迁移; Hsp-Tat 纳米粒能将Cy3-siRNA转运至细胞内, 可作为一种安全高效的非病毒核酸递送载体.        

羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d基因的克隆,原核表达,以及纯化,根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白Omp25d蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为650bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-Omp25d。在大肠杆菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定GST-Omp25d蛋白。结果成功地构建了pGEX-4T-1-Omp25d原核表达载体并在大肠杆菌中表达了Omp25d基因,纯化后所获得的融合蛋白与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pGEX-4T-1-Omp25d元和表达载体,并且在大肠杆菌中进行表达,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。     

青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

为表达青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR),构建了TSHR基因的原核表达载体pGEX-4T-1-TSHR,并将其转化入大肠杆菌DH5α中.采用IPTG诱导蛋白表达,并用SDS-PAGE分析表达蛋白.利用抗TSHR多克隆抗体进行Western blot检测.结果表明重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达,融合蛋白的分子大小约为76kDa,Western blot检测说明得到的融合蛋白为TSHR蛋白,成功构建了文昌鱼TSHR基因的原核表达载体.     

播娘蒿DsCOR基因的原核表达、蛋白纯化、及性质研究

利用PCR方法扩增DsCOR基因的蛋白编码序列，经BarnH Ⅰ、Sac Ⅰ酶切后连接入pET32a原核表达载体，构建的pET32a—DsCOR融合重组表达质粒转化大肠杆菌BL21进行原核表达．建立了“煮沸-镍离子亲和层析”的蛋白纯化方法．对纯化的DsCOR蛋白进行高温耐受性、pH耐受范围、紫外耐受性方面的研究．     

PEP-3与HBc融合原核表达载体的构建与表达

以可诱导较强免疫反应及呈现高拷贝抗原小肽的乙肝病毒核心蛋白(Hepatitis B Virus Core Protein,HBc)类病毒颗粒(Virus-like Particles,VLPs)作为免疫载体蛋白,通过分子生物学手段,将蓝白班筛选元件Lac Zα插入HBc的主要免疫显性区域,构建获得外源小肽与HBc融合的通用原核表达载体。在此通用载体的基础上,通过PEP-3小肽替换Lac Zα片段,构建了PEP-3与HBc融合原核表达载体,并成功进行了HBc/PEP-3融合蛋白的表达及纯化。该新型通用载体的成功构建,将为小肽疫苗的研究及应用提供有效工具。     

AtPCS1基因的原核表达及多抗血清的制备

利用RT-PCR扩增拟南芥螯合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列,构建原核表达载体pET28a-AtPCS1并测序.将该载体转化大肠杆菌BL21,用0.75mmol/LIPTG诱导融合蛋白AtPCS1-His的表达,纯化该融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠,ELISA法测定抗血清的效价可达1:2000.抗血清与融合蛋白及拟南芥总蛋白的western-blot结果表明:制备的抗血清具有较高的活性和特异性.     

小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠand XhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。异丙基β—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3．1载体中;pcDNA3．1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP—c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS—PAGE证实融合蛋白表达成功。说明：成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His／mlrpS融合蛋白。     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

海南斑等蝎钾通道阻断剂Im58的克隆、表达、纯化和鉴定

为表达钾离子通道阻断剂Im58,设计了4条搭桥PCR引物,通过overlap PCR的方法扩增出蝎毒肽Im58DNA全长片段,选用表达载体pGEX-4T-1,将测序正确的克隆转化至大肠杆菌E.coli/Rosetta(DE3)中.通过检测不同诱导时间和IPTG浓度下融合蛋白的表达量,筛选出最优表达条件.表达蛋白经IPTG诱导后,融合蛋白再经GSH亲和层析柱纯化,将洗脱液经超滤浓缩脱盐、纯化后得GST-Im58融合蛋白,蛋白用小肠激酶酶切后通过RP-HPLC C18柱分离获得色谱纯的蝎毒肽.蝎毒肽通过Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳鉴定重组多肽的分子量大小和纯度,并由MALDI-TOF-MS来精确测定重组多肽的分子量.结果表明:Im58阳性克隆子证明成功构建了Im58原核表达载体,Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳和MALDI-TOF-MS鉴定Im58多肽表达纯化成功.     

麻疯树核糖体失活蛋白curcin基因的原核表达及其抗真菌活性的研究

通过PCR方法,将麻疯树核糖体失活蛋白curcin的开放阅读框片段从麻疯树总DNA中扩增出来.并将该克隆基因片段连接到原核表达载体pQE-30中,成功构建了重组质粒pQE-C,转化大肠杆菌M15菌株.经IPTG诱导后,curcin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达.然后通过纯化原核表达产物,得到纯化的curcin重组蛋白,并以纸片法进行体外抗菌活性检测,发现其具有较强抗真菌活性.     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

利用天然油体纯化原核表达蛋白的方法研究

以脂肪酶为例,探索一种利用天然油体纯化原核表达蛋白的新方法.将已经构建的脂肪酶和油体蛋白基因的融合表达载体(pET32a-Jco2-Xa-LipA),在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.提取植物天然油体在超声条件下与原核表达蛋白重构,由于油体蛋白的强疏水性和脂肪酶亲水性特性可以使得油体标记的脂肪酶固定在油体的表面.通过Factor Xa消化油体蛋白和脂肪酶之间的链接Linker后,通过离心分离,可快速实现脂肪酶的纯化.     

麻疯树脱氢抗坏血酸还原酶基因克隆及重组蛋白纯化

利用RACE技术克隆出麻疯树脱氢抗坏血酸基因JcDHAR,构建原核表达载体pET-28a-JcDHAR,并对重组菌表达的条件进行了优化,进而进行Ni亲和层析纯化蛋白.结果表明:表达产物与预期大小相符,His-JcDHAR蛋白质的分子质量为30kD;在37℃的条件下0.1mM的IPTG诱导表达5h时,获得了可溶性重组蛋白,通过体外酶学反应鉴定,纯化样品具有酶学活性,表明JcDHAR原核表达成功.     

蜂毒素-SP94杂合基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

用可以特异结合到肝癌细胞膜上的小肽SP94,与蜂毒素连接,构建重组表达载体pET32a-蜂毒素-SP94.转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达结果,产物经Ni-NTA Agrosc亲和层析柱纯化后进行Tricine-SDS-PAGE检测.重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,约占细胞总蛋白...     

绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定

绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和p GEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×10~4和5.2×10~4的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0339基因的原核表达及免疫反应性分析

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339进行了表达纯化、免疫反应性分析,并研究了该蛋白对胚胎滋养层细胞(HPT-8)的细胞因子表达的影响。首先从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0339基因片段,亚克隆至融合表达载体p ET-28a,构建表达重组质粒p ET-28a-BMEI0339,并利用大肠杆菌进行表达。Western blotting方法检测其免疫学特性;用纯化的重组蛋白感染细胞,并检测IL-1、IL-10和TNF-α表达量。结果显示:成功构建了p ET-28a-BMEI0339原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BMEI0339蛋白,Western blotting检测其具有免疫反应性,该蛋白作用细胞后发现TNF-α的表达量低于BSA对照组,差异极显著(P0.01);IL-1和IL-10的表达量差异不显著(P0.05)。本研究成功表达了布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339,证实其具有一定的免疫原性,表明该蛋白影响了胚胎滋养层细胞TNF-α的表达。本研究为研究布鲁氏菌感染宿主细胞的致病机理提供理论基础。     

表皮生长因子受体Ⅲ型变异体(EGFRvⅢ) 多克隆抗体的制备及特异性

为了制备针对EGFRvⅢ的特异性多克隆抗体,在实验中利用耦联了血蓝蛋白的EGFRvⅢ特异性的PEP3合成短肽进行动物免疫,制备抗血清;构建了pET30a/E33XI原核表达载体,表达和纯化了融合蛋白His-E33(EGFRvⅢ的部分胞外区);以此融合蛋白作为抗原制备了抗体纯化柱,通过柱上纯化的方法从抗血清中提取针对EGFRvⅢ的特异性抗体.利用U87、U251、HeLa和HEK-293细胞进行免疫组化实验来检验抗体的特异性.     

拟南芥蛋白激酶SnRK1α1亚基和α2亚基蛋白纯化

为了构建拟南芥蛋白激酶SnRK1α1基因和SnRK1α2基因的原核表达载体,表达并纯化SnRK1α1和SnRK1α2蛋白,以拟南芥Col-0的cDNA为模板,分别扩增得到SnRK1α1基因和SnRK1α2基因.将其分别构建到含有GST标签的载体PGEX-4T-3上,得到SnRK1α1的原核表达载体GST-SnRK1α1和SnRK1α2的原核表达载体GST-SnRK1α2.菌落PCR扩增鉴定到的阳性克隆测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析表明,在18℃,0.5mmol/L IPTG诱导条件下,GST-SnRK1α1和GST-SnRK1α1融合蛋白都能够高效、正确的表达.GSTSnRK1α1和GST-SnRK1α2融合蛋白的大小均为84ku.经过GST标签蛋白纯化,得到了纯化的GST-SnRK1α1融合蛋白,为进一步认识SnRK1复杂的三聚体结构以及SnRK1蛋白激酶的理化性质奠定了基础.     

卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础.