小鼠ZP2 mRNA在卵泡颗粒细胞层的表达

目的:明确小鼠透明带ZP2蛋白的细胞来源。方法:采用组织原位杂交技术检测小鼠卵泡中的ZP2mRNA的表达,通过灰度测量比较小鼠ZP2mRNA在小鼠不同阶段卵泡颗粒层细胞的表达。结果:小鼠ZP2RNA探针与小鼠各级卵泡都有杂交信号,而在卵泡的颗粒细胞也有明显信号,颗粒细胞层的信号强度随卵泡发育而不同,初级卵泡的颗粒细胞层信号最弱,腔囊卵泡的颗粒细胞层信号最强。结论:小鼠ZP2mRNA在小鼠卵泡颗粒细胞层也表达,而非卵母细胞特异产生。     

重组IL-5质粒pVAX1-mIL-5增强卵透明带DNA避孕疫苗黏膜免疫效能

目的:探讨利用白细胞介素5作为DNA疫苗佐剂增强黏膜免疫反应,提高卵透明带DNA避孕疫苗抗生育效能的可行性。方法:用pVAX1-m IL-5和卵透明带避孕疫苗pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒口服免疫雌性小鼠,共设3组,每组6只。A组单独用50μg pVAX1-pZP3α免疫;B组用疫苗加等量的pVAX1-m IL-5质粒为佐剂共免疫;C组为空白对照组。每组动物接受3次免疫(第0、3、6周)。采用ELISA法检测小鼠血清及阴道冲洗液中抗pZP3 IgA抗体。第10周雌雄交配,统计雌鼠怀孕情况;第16周取双侧卵巢作石蜡连续切片,光镜观察卵巢病理学变化。结果:B组全部小鼠血清抗体呈阳性反应,A组只有3只小鼠血清抗体呈阳性反应,且B组小鼠的抗体滴度水平均高于A组小鼠;抗生育率B组小鼠为100%,A组小鼠为50%,C组小鼠为0%,2检验分析结果表明各组间的差异有统计学意义,抗生育效能与交配时抗pZP3 IgA抗体的强度有关;卵巢切片的组织病理学观察结果表明,有抗生育效能的小鼠卵巢组织可观察到各级形态正常的卵泡,无淋巴细胞浸润,与对照组及无抗生育效能的小鼠卵巢结构无差异。结论:利用重组质粒pVAX1-m IL-5与卵...     

五味子中残留农药对卵巢颗粒细胞的毒性研究

探讨五味子中残留农药对卵巢颗粒细胞的毒性作用.MTT法测定农药提取物作用于卵巢颗粒细胞24、48、72 h后的细胞增殖情况;Western blot法检测农药提取物对卵巢颗粒细胞MAPK信号通路的ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达水平的影响.MTT结果显示农药提取物能够显著促进卵巢颗粒细胞增殖,48 h增殖率最高(P0.01),Western blot结果显示提取物能够促进ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达,与阴性对照组相比差异极显著(P0.01).因此农药提取物作用于体外培养的卵巢颗粒细胞能够显著促进细胞增殖,通过促进MAPK信号通路的ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达,对颗粒细胞产生毒性作用.     

小鼠ZP2肽的基因克隆和原核表达载体的构建

目的:克隆小鼠卵透明带2(mZP2)肽的基因并构建原核表达载体.方法:从小鼠卵巢组织中分离出mRNA,并以此作为模板,通过RT-PCR扩增出小鼠ZP2肽的cDNA片段,将其克隆到pET原核表达载体.将该重组mZP2基因转化Rosetta-gami(DE3)pLysS菌,通过SDS-PAGE和Western blotti...     

小鼠口服猪卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α的抗生育研究

目的:评价口服卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒诱发的黏膜免疫反应、抗生育作用和对卵巢结构的影响,探讨用黏膜免疫避免卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的可行性.方法:制备pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒,10只昆明系小鼠口服免疫,第3周和第6周分别加强免疫一次,剂量为0.5 mL/只,含pVAX1-pZP3αDNA 50μg;对照组10只雌小鼠口服相同剂量不含pVAX1-pZP3α的壳聚糖.免疫前和免疫后隔周取小鼠血清、阴道冲洗液,用ELISA法检测抗pZP3 IgA和IgG.首次免疫后第12周雌雄合笼交配,统计雌鼠怀孕情况;解剖取出双侧卵巢,制作石蜡切片,光镜观察卵巢病理学变化.结果:免疫组80%小鼠的血清和50%小鼠的阴道冲洗液可检测到抗pZP3 IgA,反应强度与持续时间有明显的个体差异;免疫组5只小鼠未怀孕,对照组全部怀孕,抗生育效果与合笼时抗pZP3 IgA反应有关;免疫组未怀孕小鼠卵巢组织结构与免疫组怀孕小鼠及对照组小鼠无差别.结论:口服pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒免疫小鼠能诱发生殖道黏膜免疫反应,发挥抗生育作用,对卵巢组织结构没有影响.黏膜免疫是克服卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的一种值得深入研究的方法.     

卵巢自身胰岛素抵抗放大其颗粒细胞增殖功能

探讨在卵巢自身胰岛素抵抗情况下,颗粒细胞增殖能力、雌激素合成能力的改变。方法是以猪卵巢颗粒细胞作为体外研究对象,利用磷酯酰肌醇-3激酶(PI-3K)特异性抑制剂——渥曼青霉素(Wortamanni,WT)人工诱导胰岛素抵抗的细胞模型。结果显示:①处理组细胞的葡萄糖摄取能力明显低于正常组细胞的葡萄糖摄取能力(756.25±158.81cpm/2×104cellsvs1144.75±81.09cpm/2×104cells,p<0.05);②处理组细胞中有丝分裂激活蛋白激酶1(MAPK1)和MAPK2蛋白的表达水平高于对照组,而该蛋白磷酸化p-MAPK蛋白的表达低于对照组;③处理组卵巢细胞MAPK、增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达(相对灰度)升高;④在胰岛素抵抗的状态下,雌激素以及芳香化酶的表达显著上调。结论为卵巢颗粒细胞的自身胰岛素抵抗,明显提高其分裂增殖能力和雌激素合成效能,该机制可能是PCOS卵巢在超排过程中易发卵巢过度刺激综合的重要机制。     

中药复方液对麻黄素损伤小鼠卵巢的保护作用

为了研究中药对麻黄素损伤小鼠卵巢的影响,将60只受孕小鼠随机分为对照组、麻黄素组与中药组.对照组腹腔连续注射生理盐水,麻黄素组与中药组均腹腔注射0.2mL 6g·L-1麻黄素溶液,中药组在注射麻黄素溶液1h后灌胃0.3mL的中药复方液.在处理15、20、25d后,分别用ELISA法测定小鼠血浆中肾上腺素(EPI)、雌二醇(E2)含量的变化,用比色法检测卵巢组织SOD活性及MDA含量的变化,称量卵巢重量,用生物显微技术观察卵巢组织的显微结构,计数次级卵泡与闭锁卵泡数量,测量次级卵泡直径,用免疫组织化学法检测Bax蛋白在卵巢组织中表达的变化.结果显示,麻黄素组小鼠血浆EPI浓度升高,E2浓度降低,卵巢组织SOD活性降低,MDA含量升高,次级卵泡与闭锁卵泡数量增多,次级卵泡直径减小,卵巢组织受损,结构紊乱,颗粒细胞排列松散、降解,黄体细胞核固缩,Bax蛋白的表达增强.与麻黄素组相比,中药组小鼠血浆中EPI浓度降低,E2浓度升高,卵巢组织SOD活性明显升高,MDA含量降低,卵巢结构清晰,次级卵泡数量减少,颗粒细胞排列紧密整齐,崩解减少,Bax蛋白的阳性表达明显减少.研究结果表明,中药复方液对麻黄素损伤小鼠卵巢有一定的保护作用,这可能与SOD活性和Bax蛋白的表达有关.     

一种检测蛋白质相互作用的双荧光共定位系统

自发荧光蛋白以快捷灵敏、即时检测和无需破坏活细胞的特点在蛋白质相互作用的研究中得到广泛应用.从发光水母Aquoria victoria中分离的绿色荧光蛋白(GFP)和从珊瑚Discosoma sp.中分离的DsRed红色荧光蛋白是自发荧光蛋白的典型代表.本研究开发一种基于GFP和红色荧光蛋白(RFP),并可通过待检测蛋白在细胞内表达的空间位移变化产生共定位的双荧光共定位检测系统.该系统为克服两种荧光蛋白光谱渗漏带来的非特异性结果的干扰,将核仁定位信号(NoLS)和出核信号(ABL)分别连接到RFP和GFP.具有定位信号的GFP和RFP的待检测蛋白对可分别在细胞核内和(或)细胞核外表达,伴随它们的相互作用,荧光共定位的现象会产生在细胞内特定的区域.利用抗凋亡蛋白Bc1-2和Bak-BH3短肽作为蛋白对测试该系统,荧光共定位现象明显,系统灵敏可靠.     

卵泡刺激素促进卵巢颗粒细胞增殖分化的信号通路的研究进展

卵泡刺激素（FSH）是一种垂体前叶合成和分泌的糖蛋白激素,是卵巢发育的重要激素,可与卵巢颗粒细胞膜上的特异性受体结合从而促进细胞的增殖分化,激活细胞内芳香化酶生成雌激素和孕激素。FSH在卵巢颗粒细胞中主要依靠cAMP—PKA信号通路促进细胞增殖,同时也发生多种信号通路,ERK1／2、ERK5、p38MAPK、P13K／Akt、VEGF均参与FSH促进卵巢颗粒细胞的增殖分化;它们之间相互作用促进卵巢颗粒细胞的增殖。     

OSP-1启动子在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性研究

为获得能在猪卵巢颗粒细胞中高效表达的启动子,本文检测了大鼠卵巢特异性启动子OSP-1(Ovarian specific promoter)在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性。参考大鼠OSP-1启动子序列扩增大鼠OSP-1片段,将其定向克隆到pc DNA3.1(+)中替代CMV启动子,并在其下游插入Zs GREEN基因片段,构建真核表达载体p OSP-1-Zs GREEN;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000的介导下转染不同细胞,在荧光显微镜下观察Zs GREEN表达情况,Realtime-RT-PCR方法检测该启动子在不同细胞中启动Zs GREEN基因表达的活性。结果表明:经克隆测序,得到了465bp OSP-1启动子序列,重组质粒转染卵巢颗粒细胞、Hela细胞可以观察到绿色荧光。Realtime-RT-PCR结果显示:Zs GREEN基因在卵巢颗粒细胞、Hela细胞中高表达,在肌细胞中表达量极低;说明OSP-1启动子可驱动外源基因在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,可为构建可用于猪卵巢颗粒细胞的表达载体提供了启动子。     

小鼠口服猪卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3a的抗生育研究

目的：评价口服卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3a壳聚糖纳米微粒诱发的黏膜免疫反应、抗生育作用和对卵巢结构的影响，探讨用黏膜免疫避免卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的可行性。方法：制备pVAX1-pzP3a壳聚糖纳米微粒，10只昆明系小鼠口服免疫，第3周和第6周分别加强免疫一次，剂量为O．5ml／只，含pVAXl-PZP3aDNA 50μg；对照组10只雌小鼠口服相同剂量不含pVAX1-pZP3a的壳聚糖。免疫前和免疫后隔周取小鼠血清、阴道冲洗液，用ELIASA法检测抗pzP3 IgA和IgG。首次免疫后第12周雌雄合笼交配，统计雌鼠怀孕情况；解剖取出双侧卵巢，制作石蜡切片，光镜观察卵巢病理学变化。结果：免疫组80％小鼠的血清和50％小鼠的阴道冲洗液可检测到抗pzP3 IgA，反应强度与持续时间有明显的个体差异；免疫组5只小鼠未怀孕，对照组全部怀孕，抗生育效果与合笼时抗pzP3 IgA反应有关；免疫组未怀孕小鼠卵巢组织结构与免疫组怀孕小鼠及对照组小鼠无差别。结论：口服pVAX1-pZP3a壳聚糖纳米微粒免疫小鼠能诱发生殖道黏膜免疫反应，发挥抗生育作用，对卵巢组织结构没有影响。黏膜免疫是克服卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的一种值得深入研究的方法。     

55K猪卵透明带抗原(ZP3)的分离纯化

高分辨双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D－PAGE）研究表明，猪卵透明带是由相对分子质量分别为82000、61000、55000和21000的4个系列蛋白组分组成，其中55000组分含量丰富，是免疫显性的，同时又具有精子受体活性，是研究卵透明带避孕疫苗的重要抗原组分。为深人研究猪卵透明带55K组分的抗生育机制、生化和免疫学特性，本研究建立了一套从猪卵巢分离纯化ZP3组分的方法。猪卵巢于室温解冻后用自制排刀逐一切割，用卵巢处理液（2InlnOUL柠檬酸钠，0．ofmoUryBS，PH7．2）充分泡洗，泡洗液用不同孔径的尼龙网过滤，收集75ap和45mp网上的卵子…     

卵表面精子受体糖蛋白(ZP)基因的研究

哺乳动物卵透明带（ZP）是环绕卵细胞外的一种糖蛋白基质,它在卵母细胞发育、卵细胞受精和受精卵发育中起着重要作用。从小鼠ZP研究中发现ZP是由3种糖蛋白ZPI、ZPZ和ZP3组成,其中ZP3是精子受体蛋白具有特别重要的功能。由于ZP糖蛋白在控制受精作用和调控生殖中具有重要意义,因此对ZP糖蛋白的研究已成为生殖分子生物学的一个重要的热点80年代科学工作者分别从小鼠、兔和人组织中应用基因工程技术研究了ZP糖蛋白基因,特别对ZP3基因作了比较详尽的研究。IZP糖蛋白基因的分离和克隆RingUette（1986）从小鼠卵巢中提纯mRNA,经…     

鲇卵膜形成和卵黄发生的超微结构观察

对鲇 (SilurusasotusLinnaeus)卵母细胞发育过程的超微结构变化进行观察 .鲇成熟卵卵膜明显区分为内放射带、外放射带和透明带等 3层结构 ,透明带为颗粒细胞分泌形成 ,内、外放射带则由卵母细胞本身分泌形成 .鲇卵母细胞内卵黄颗粒的形成经历几个阶段 :卵黄蛋白原、卵黄前体颗粒、卵黄中间颗粒 ,最后形成卵黄颗粒 ,其合成或加工分别在肝脏、颗粒细胞和卵母细胞内进行 .结果还讨论了卵黄核、合成泡及环状片层等细胞器的超微结构与功能的关系等 .     

不孕妇女血清中卵透明带抗体的检测

利用与人卵透明带有交叉免疫反应的猪ZP3抗原，建立起不孕妇女血清卵透明带抗体检测的ELISA技术，并对120例不孕妇女血清进行了检测，发现15例透明带抗体阳性血清。该法灵敏、特异，稳定性和重复性好，易于在临床推广应用。     

caveolin-1 siRNA对成釉细胞中CD147糖基化及MMP-2表达的影响

目的:研究caveolin-1的表达对小鼠成釉细胞CD147糖基化及MMP-2表达的影响.方法:首先利用细胞免疫荧光技术检测体外培养的小鼠成釉细胞中caveolin-1、CD147和MMP-2蛋白的表达;然后利用siRNA技术封闭小鼠成釉细胞中caveolin-1的表达,实时定量荧光PCR和免疫印迹试验分别检测caveolin-1、CD147和MMP-2在转录水平和蛋白水平的表达情况,并统计学分析.结果:caveolin-1、CD147和MMP-2蛋白表达于体外培养的小鼠成釉细胞中;caveolin-1siRNA转染成釉细胞后caveolin-1mRNA和MMP-2mRNA的表达量明显降低,但CD147mRNA的表达量没有明显变化;caveolin-1、高糖型CD147和MMP-2的蛋白表达量均降低.结论:caveolin-1、CD147和MMP-2表达于小鼠成釉细胞中,提示3者参与成釉细胞生物学过程;在体外培养的成釉细胞中,封闭caveolin-1基因的表达可降低HG-CD147和MMP-2的表达.     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

人卵透明带蛋白3差异表达菌的鉴定及比较

目的:研究重组人卵透明带ZP3蛋白的差异表达情况.方法:构建8个重组rhZP3的差异表达质粒在毕赤酵母中进行诱导表达,研究跨膜区保留与否、潜在酶切位点突变与否及多聚组氨酸纯化标签设计的位置是否影响rhZP3的表达情况.结果:保留跨膜区会影响重组蛋白泌出胞外而使表达量降低,潜在酶切位点存在会导致重组蛋白被不完全降解,而多聚组氨酸纯化标签设计位置对表达也有一定影响.结论:从表达量和产物完整性综合考虑,以突变型成熟肽为佳,含跨膜区的蛋白则应选用pPICZaA质粒,以便富集得到完整的表达蛋白.     

Smurf2单克隆抗体的制备与鉴定

Smad泛素调节因子家族的两个E3泛素连接酶成员Smurf1和Smurf2 (Smad ubiquitin regulatory factor 1 and 2)具有至少80％的同源性.为了更好地研究它们的功能,需要获得一个能区分Smurf1和Smurf2的单克隆抗体.选取Smurf2与Smurf1蛋白序列中仅有的非同源区域序列作为抗原免疫Bal b/C小鼠,成功制备若干株能稳定分泌抗Smurf2抗体的杂交瘤细胞株.对所获得的单克隆抗体的效价和特异性等进行一系列检测,结果表明该抗体能特异性地识别过表达及细胞内源Smurf2蛋白.此外该抗体能被应用于Western blot和免疫荧光实验,从而为深入研究Smurf2的细胞生物学功能提供了良好的实验基础.     

弓形虫SAG1,ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究

目的 检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果.方法 将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体,构建重组质粒;RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达;通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫;腹腔内注射毒性株弓形虫速殖子攻击免疫小鼠.结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达;SAG1和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫,对于毒性株弓形虫感染攻击具有保护作用.结论 不同候选抗原编码基因重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示含有多种成分的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一.