油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.     

青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的克隆及其在鳗弧菌胁迫下的表达分析

采用Illumina MiSeq二代测序方法筛选得到青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38)基因相似序列,进一步克隆得到全长cDNA.利用荧光定量PCR技术检测该基因在青蛤各组织中以及在鳗弧菌胁迫下的组织表达特征.结果显示,该基因全长共1781bp,开放阅读框长度为1104bp,编码367个氨基酸.在正常条件下该基因在青蛤体各组织中都表达,其中血淋巴中表达量最高,肝脏次之,鳃中最少.经菌液侵染后12h青蛤血淋巴中表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.     

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。     

拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达

热休克蛋白70(HSP70)是一种重要的功能蛋白.利用RACE和基因克隆等分子生物学技术,获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)HSP70全长cDNA序列,全长共2 189 bp,包括110 bp的5′UTR(untranslated regions)、126 bp的3′UTR和一个1 953 bp的开放阅读框(ORF).ORF可编码650个氨基酸残基,总分子质量约为71.2 ku,pI为5.38.同源蛋白的比较结果显示,拟穴青蟹HSP70序列与其他一些物种具有很高相似性,推测HSP70基因具有很高的遗传保守性,而基于HSP70氨基酸序列比对而绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测雌性拟穴青蟹一些组织中的HSP70表达,结果显示各待测组织中均能扩增得到HSP70,说明HSP70在拟穴青蟹为组成型表达.其中,HSP70在卵巢中表达量最高,其次为脑神经节,推测这与HSP70作为分子伴侣的功能相关.     

中国鲎β-actin基因的克隆与组织表达

中国鲎(Tachypleus tridentatus)是一种古老的海洋动物.利用RT-PCR和RACE等分子生物学技术,获得中国鲎β-肌动蛋白基因(中国鲎β-actin,简称为TTBA)全长cDNA序列,总共1 515bp,包括70bp 5′非编码区(untranslated regions,UTR)、314bp 3′UTR和一个1 131bp的开放阅读框(open reading frame,ORF).ORF可编码376个氨基酸残基,总分子质量约为41 807.7u.同源蛋白的序列比较结果显示,TTBA推导氨基酸序列与其他物种具有很高的相似性,推测β-actin基因具有很高的遗传保守性.而基于β-actin蛋白序列比对而绘制的系统进化树显示中国鲎与其他节肢动物具有较高的相似性,此结果与其现行的分类地位基本一致.以Real-time RT-PCR法检测表明,在卵子发生各期的卵巢组织中TTBA表达量保持稳定(p>0.05),可作为定量检测的内参基因.     

短小芽孢杆菌(Bacillus p umilus )糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组 DNA 为模板,利用简并PCR 技术扩增到基因(GT‐A )全长序列.该序列全长1287 bp 、编码423个氨基酸,分子量约为49.2 KD .经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据 GT‐A 基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA‐pet28a ,并在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50 kD 的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

根据 GenBank 中 NDP kinase 的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成 NDP kinase 基因,构建原核表达载体 pET28a-NDP kinase 并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后 NDP kinase 基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中该基因经 IPTG 诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95;以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶（NDP kinase）基因的 pET28a 原核重组质粒,为进一步研究 NDP kinase 在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.     

异色瓢虫的HSP 90基因的克隆与特性分析

 采用同源克隆和锚定PCR技术, 从异色瓢虫 Harmonia axyridis (Pallas)中克隆到热休克蛋白HSP 90 基因的cDNA全序列（Genbank number: FJ501962）。cDNA全长2 480 bp,包含3′非编码区域(UTR)为200 bp和5′UTR为126 bp,开放阅读框(ORF) 长2.154 bp,编码717个氨基酸。预测的相对分子质量为82.230, 理论等电点为4.96,无糖基化位点、跨膜结构和信号肽。在N端具有 HSP 90 基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列EEVD。与赤拟谷盗 Tribolium castaneum 相比较,同源性高达90%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。 HaaHSP 90 基因的克隆和比较分析为进一步深入研究异色瓢虫的抗逆机理及其进化具有重要意义。     

异色瓢虫的HSP90基因的克隆与特性分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)中克隆到热休克蛋白HSP90基因的cDNA全序列(Genbank number:FJ501962)。cDNA全长2 480 bp,包含3′非编码区域(UTR)为200 bp和5′UTR为126 bp,开放阅读框(ORF)长2 154 bp,编码717个氨基酸。预测的相对分子质量为82 230,理论等电点为4.96,无糖基化位点、跨膜结构和信号肽。在N端具有HSP90基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列EEVD。与赤拟谷盗Tribolium castaneum相比较,同源性高达90%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。HaaHSP90基因的克隆和比较分析为进一步深入研究异色瓢虫的抗逆机理及其进化具有重要意义。     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.     

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。     

南方鲇(Silurus meridionalis)神经肽Y基因cDNA克隆及组织表达分析

以南方鲇(Silurus meridionalis)为对象,运用RT-PCR和RACE技术,获得神经肽Y(Neuropeptide Ty-rosing,NPY)基因cDNA的全序列.该基因cDNA全长743bp,包括3′非编码区(UTR)373bp,5′非编码区(UTR)82bp,开放阅读框(ORF)288bp,编码95个氨基酸.与其他脊椎动物进行同源性分析发现,南方鲇NPY序列与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的同源性最高,达79%,其次为瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii),同源性达76%.进化树分析也表明,南方鲇与斑点叉尾鮰和瓦氏黄颡鱼聚为一支.qPCR显示,南方鲇NPY mRNA在脑、心脏、肾脏、鳃、胃、肠和肝等7种组织中都有不同程度的表达,其中在脑中的表达量最高.     

斧翅沙芥蔗糖转运蛋白基因PdSUT4的克隆与表达分析

通过5′和3′cDNA末端快速扩增方法获得PdSUT4基因序列,利用生物信息学软件预测蛋白质理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性,同时用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行PdSUT4基因表达模式分析.结果表明,从斧翅沙芥克隆得到的PdSUT4基因cDNA全长为2005 bp,开放阅读框1536 bp,编码511氨基酸,相对分子质量为55087.44,等电点为9.26,PdSUT4蛋白含有12个跨膜结构域,具有高等植物蔗糖/H~+共转运家族和协助扩散超家族的保守结构域,与多种植物SUT4基因编码的蛋白有较高的一致性;干旱胁迫下斧翅沙芥PdSUT4基因表达量迅速升高.PdSUT4基因的克隆与表达分析为进一步研究该基因在斧翅沙芥生长发育、逆境生理的生物学功能奠定了基础.     

麻疯树亚硝基谷胱甘肽还原酶（JcGSNOR）的克隆与功能分析

本研究克隆出了麻疯树亚硝基谷胱甘肽还原酶（JcGSNOR）cDNA的全长序列,并分析了其在麻疯树各部位中的表达情况.结果表明,在所有参试的器官中,JcGSNOR基因皆有表达,其中在种子种表达量最大,其次为根茎,叶表达量最少.对新基因编码蛋白的理化性质进行分析后发现JcGSNOR的分子量约为40.256 kDa,等电点约为6.74;同源性分析表明,JcGSNOR基因与其它植物GSNOR基因核甘酸序列相似度达到80%以上,说明JcGSNOR是GSNOR蛋白家族的一个新发现的成员.同时将JcGSNOR基因与pY     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

采用RT-PCR技术克隆牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的全长基因,并根据序列设计带有酶切位点的特异性引物对所得cDNA的开放阅读框进行扩增,将所得基因片段克隆到PET-28a载体.结果克隆了牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的完整基因,所克隆的基因开放阅读框全长为429 bp,编码142个氨基酸,该蛋白相对分子质量约为16 265,等电点为6.10,与理论值相符.通过与Genbank中已有序列比对分析,同源性高达100%.实现构建该基因的PET-28a原核表达载体,为牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的相关研究奠定了基础.     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.