NaCS/PDMDAAC微囊化肺炎克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇

研究一种新型的生物微胶囊体系--NaCS/PDMDAAC,包埋肺炎克雷伯氏菌(K. Pneumoniae ZJU 5205)产1,3-丙二醇.比较不同初始菌体包埋量、胶囊/发酵液体积、发酵液pH值、初始甘油质量浓度等对微囊化细胞发酵结果的影响.结果表明,将细胞种子液稀释5倍后包埋,当胶囊与发酵液的体积比为1∶2、初始pH值为7、初始甘油质量浓度为60 g·L-1时,得到较好的发酵结果.考察肺炎克雷伯氏菌在囊内的生长曲线,以及底物和产物质量浓度随发酵时间的变化,发现由于胶囊引起的扩散限制,可以持续维持囊内较低的底物质量浓度,从而部分克服高质量浓度底物对菌体生长和生成产物的抑制.     

乙酸对1，3-丙二醇发酵的影响

考察了克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇过程中，乙酸对发酵过程的影响。结果表明，在发酵初始培养基中加入微量的乙酸能够提高1，3－丙二醇的产量，但乙酸的添加会影响菌体生长，造成发酵液的菌体吸光度A下降。通过实验确定了乙酸的最优添加质量浓度为0.6g/L，此时1,3-丙二醇质量浓度为8.46g/L，转化率为0.62；在此浓度乙酸初始培养基中添加1.2g/L葡萄糖作为辅助底物将甘油转化率提高到0.66。     

克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇代谢途径中的酶活变化

考察了不同条件下克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella.pneumoniae)合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的3种关键酶(甘油脱氢酶(GDH)、1,3-PD氧化还原酶(PDOR)及甘油脱水酶(GDHz))的表观酶活变化。结果显示:这3种酶的酶活变化与Klebsiella.pneumoniae的1,3-PD代谢不完全相关。用SDS-PAGE电泳分析上述不同发酵条件下酶活变化,结果显示不同于3种酶的蛋白条带,Mr约为4.0×104位置的蛋白条带有明显的变化,这可能与菌体代谢过程相关,结论有待进一步深入研究。     

两阶段控制甘油浓度提高1,3-丙二醇发酵水平

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)分批发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD),根据菌体生长、产物生成和补料可将发酵过程分成4个阶段.不同阶段控制不同的底物浓度会对菌体生长和产物生成产生不同的影响.研究发现,菌体生长阶段(阶段Ⅱ)底物浓度控制在6.0 g/L最适合菌体生长,产物主要生成阶段(阶段Ⅲ)底物浓度控制在18.9 g/L最适合产物生成,菌浓可达7.83 g/L,最终1,3-PD的浓度为68.5 g/L,摩尔转化率为61%,生产强度为2.21 g/(L·h).     

克雷伯杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质

在有氧条件下,利用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子离子交换层析和Blue Sepharose CL-6B亲和层析,同时分离并提纯克雷伯杆菌胞内的1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶.研究表明,1,3-丙二醇氧化还原酶的纯化倍数为35.86倍,回收率为5.17%,该酶最适表观反应温度为57 ℃,最适反应pH值为9.5.在30 ℃及pH=8.0～10.0时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH=9.5条件下,该酶以1,3-丙二醇和NAD+为底物,其米氏常数Km分别为15.8,0.2 mmol·L-1.1,3-丙二醇氧化还原酶对生理反应底物3-羟基丙醛活性最大,对其他醇类也有氧化能力.Mn2+对酶有显著激活作用,巯基保护剂能明显提高酶的活力.     

两种策略实现1,3-丙二醇关键酶基因的共表达

甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是甘油歧化为1,3-丙二醇(1,3-PD)的两个关键酶。采用多顺反子重组和质粒共存两种策略,对来自克雷伯肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)的两个关键酶进行共表达。构建表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT将两酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔,在E.coli BL21(DE3)高水平共表达了GDHt 3个亚基和PDOR,表达蛋白分别约占菌体总蛋白的18%、9%、7%和9%。质粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共转化E.coli BL21(DE3)得到稳定的双质粒系统,48h后84%的细胞能同时含有两种质粒,GDHt 3亚基和PDOR分别约占菌体总蛋白的16%、8%、6%和14%。两种酶在两种表达方法下均显示高于原始菌株的酶活力。     

发酵液中1, 3-丙二醇的萃取分离

1,3-丙二醇是新型聚酯PTT的主要原料之一.为解决传统的精馏法提取1,3-丙二醇能耗过大的问题,研究了萃取法自稀溶液中分离1,3-丙二醇的过程.结果表明,普通物理萃取和络合萃取法均不能有效分离1,3-丙二醇.在强酸性树脂催化下,通过加入乙醛与1,3-丙二醇发生可逆缩醛反应生成2-甲基-1,3-二烷和甲苯同步萃取反应产物的反应-萃取耦合方法,可以有效分离稀溶液中1,3-丙二醇, 1,3-丙二醇的总转化率为99.1%, 2-甲基-1,3-二烷的收率为91.2%, 分配系数为3.35. 1,3-丙二醇稀溶液的反应萃取过程具有良好的工业可行性.     

一类微生物发酵过程的优化

研究了甘油生物歧化为1,3-丙二醇过程的优化.首先给出了使目的产物1,3-丙二醇浓度最大的稳态优化模型,然后基于MATLAB和1st Opt软件,构造了可求其最优解的混杂优化方法,取得了较好的应用效果.     

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆、表达及其对宿主菌生长的影响

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶(Pdu P)是以甘油为底物催化合成聚3-羟基丙酸的关键酶。本研究从鼠伤寒沙门氏菌基因组中PCR扩增了pdu P基因,构建表达载体后转化肺炎克雷伯氏菌,得到重组菌K.p(p ET-pk-pdu P)。SDS-PAGE显示Pdu P实现了高效表达。生长曲线表明重组菌延迟进入平稳期,生物量较空质粒对照菌提高了24.68%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的产量分别达到16.58 g/L和15.68 g/L,甘油转化率比空质粒对照菌和原代菌分别提高了40.62%和34.02%。上述结果表明,过表达pdu P重排了代谢流量,促进了菌体生长。     

不同缓冲体系下pH值对裂褶菌F17产锰过氧化物酶的影响

研究6组缓冲体系不同的pH值对裂褶菌F17产锰过氧化物酶的影响,并比较这6组缓冲体系在裂褶菌F17产酶过程中对pH值的缓冲调节能力.结果表明,各缓冲体系对裂褶菌F17产酶的影响不同.在酸性条件下,缓冲培养基的pH值变化不大;在碱性条件下,NH4C l-氨水和2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇两种体系的缓冲调节能力较其他体系要好.灭菌后pH值为7.2~9.5的缓冲培养基有利于裂褶菌F17产锰过氧化物酶.     

微生物间歇发酵生产1,3-丙二醇过程辨识与优化

以肺炎杆菌转化甘油生成1,3-丙二醇（1,3-PD）的过程为研究体系,根据微生物间歇培养过程的特征及动态行为,建立了简化的间歇发酵过程的非线性动力系统及其参数辨识模型,论述了动力系统与辨识问题解的存在性,并求得最优辨识参数．以初始底物浓度、菌种浓度及发酵时间为控制变量,以1,3-PD的生产强度为性能指标,建立了非线性系统的最优控制模型,针对实际算例求得最优解,为1,3-PD的产业化生产设计提供理论指导．     

固定化双菌串联发酵生产1，3-丙二醇

以葡萄糖为底物，利用分别固定化的酵母Candida krusei ICM-Y-05和肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae ZJU 5205串联发酵生产1,3-丙二醇。实验结果表明，由C.krusei发酵而得粗甘油只需经简单离心后即可被K.pneumoniae所利用。将C.krusei包埋于NaCS/PDMDAAC生物微胶囊中，并于气升式反应器中发酵，所得发酵液直接流入固定床反应器，同时向固定床反应器补充微量元素，发酵培养经NaCS/PDMDAAC生物微胶囊包埋的K.pneumoniae，产物即为1,3-丙二醇。三批次发酵实验结果表明，1,3-丙二醇/葡萄糖的最终摩尔转化率为0.295。     

Rational design of glycerol dehydratase： Swapping the genes encoding the subunits of glycerol dehydratase to improve enzymatic properties

1,3-propanediol (1,3-PD) is an important material for chemical industry,and there has been always much interest in the production of 1,3-PD using all possible routes. The genes encoding glyc-erol dehydratase (GDHt) from Citrobacter freundii,Klebsiella pneumoniae and metagenome were cloned and expressed in E. coli. All glycerol dehy-dratases but the one from metagenome could be detected to show enzyme activities. In order to im-prove the enzymatic properties of GDHts,the genes encoding α and β-γ subunits were cloned,and the enzyme characteristics were evolved by rational de-sign based on their 3D structures which were con-structed by homology modeling. Six heteroenzymes were obtained by swapping the α subunit genes of these three different-source-derived GDHts. The pH,thermal stability and Vmax of some heteroenzymes were dramatically improved by 2―5 times compared with the wild one (GDHtKP). The GDHt cloned from metagenome,originally proved to be with no enzyme activity,was converted into active enzyme by swap-ping its subunits with other different GDHts. In addi-tion,the effect of subtle 3D structural changes on the properties of the enzyme was also observed.     

基于生物鲁棒性的一类微生物连续发酵优化模型及其并行算法

针对一类微生物连续发酵生产1,3-丙二醇问题,基于生物鲁棒性,建立了最优控制和优化模型.证明了最优控制解的存在性,构造了并行粒子群算法,并通过大规模并行计算得到了底物最优流加策略.数值结果显示该流加策略可以显著提高稳态时刻1,3-丙二醇的浓度.     

1,3-丙二醇脱氢酶三级结构的模建

利用生物大分子数据库及生物信息学技术,对来源于Klebsiella pneumoniae的1,3-丙二醇脱氢酶分子进行二级结构预测、多序列联配．实验发现,其具有较保守的铁离子结合位点,而未发现常见的NAD(H)结合位点．在此基础上,利用同源建模法和穿线法模建该酶的三级结构,进一步发现铁离子结合位点在空间上形成一口袋状结构．探讨对其作用机制,同时发现该序列中存在2个含铁元素的乙醇脱氢酶信号．     

微生物批式流加发酵的建模及基于HPSO算法的参数辨识（英文）

研究了微生物批式发酵甘油生产1,3-丙二醇过程的建模和参数辨识。由于流加过程中甘油和碱被间断地注入发酵罐,因而本文提出一个非线性多阶段动力系统描述该过程,并讨论了该系统的性质。以实验数据和计算值之间误差平方和最小为性能指标,建立了系统辨识模型,并证明了参数的可辨识性。最后构造了混杂粒子群算法求解该参数辨识模型,数值结果表明实验观测值和计算值之间的误差比已有文献降低了1.76%～41.77%,因而该系统能更好的描述批式流加发酵过程。     

改进的微生物连续发酵动力系统及参数辨识

以微生物连续发酵生产1,3-丙二醇为背景,研究了非线性动力系统及其参数辨识问题.首先根据发酵过程的特征和动态行为,在底物甘油过量的条件下,考虑了细胞内甘油与1,3-丙二醇的浓度变化,改进了描述微生物连续发酵过程的非线性动力系统,分析并论述了该非线性动力系统的主要性质;其次以平均相对误差为性能指标,建立了参数辨识最优化模型,并用粒子群算法求解.计算结果表明,该模型适合描述主要产物1,3-丙二醇的动态行为,但用来描述副产物的浓度变化率不够精确.     

微生物转化法生产1,3-丙二醇的研究进展

综述微生物转化法生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的研究进展,包括发酵菌种和发酵工艺等.生物转化法生产1,3-PD与化学法相比,具有选择性好、转化率高、分离纯化简单、无污染、利用可再生资源等优点.要使生物转化法生产1,3-PD能与化学法竞争,在提高1,3-PD发酵生产水平的同时,必须有效降低生产成本.以生物柴油副产物废甘油为发酵底物生产1,3-PD,可大大降低1,3-PD生产成本,同时解决废甘油高附加值利用的问题,延长产业链.但存在的问题是废甘油成分复杂,抑制了微生物的生长和代谢.