大熊猫核糖体蛋白L34基因cDNA克隆与蛋白特性

为进一步研究RPL34的结构基因,也为更深入开展大熊猫分子生物学研究积累科学资料,本研究采用RT-PCR方法,首次成功克隆了大熊猫的核糖体蛋白L34基因的cDNA序列,对克隆序列进行了测序及初步分析,并利用RPL34蛋白构建系统树.结果表明:大熊猫RPL34基因的表达序列全长为379 bp,ORF为354 bp,编码117个氨基酸的蛋白质,该蛋白分子量为13.292 9 kD,等电点(pI)为11.48,含有5种类型共11个功能位点.进一步分析发现,该基因与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等物种的编码序列及其编码的氨基酸序列同源性很高,蛋白质分子量、pI非常接近,功能位点基本相同,说明核糖体蛋白L34基因及其编码蛋白在进化过程中非常保守;进化树分类结果与传统分类一致,表明L34蛋白能很好的反映物种间的进化关系.     

茶氯香酰胺脂质体对人肝癌细胞生长和迁移的抑制作用

以茶氯香酰胺脂质体(TClC-L)为研究对象,研究其对人肝癌细胞(SMMC7721)生长和迁移的影响,并且探索其作用的分子机制,为研发抗肝癌新药提供科学依据.应用MTT法检测TClC-L对SMMC7721细胞生长的影响;应用划痕法和细胞流式分别检测TClC-L对SMMC7721细胞迁移和死亡的影响;应用Hoechst 33258染色检测SMMC7721细胞凋亡形态学变化;应用Western blotting技术检测TClC-L对SMMC7721细胞生长、凋亡和迁移密切相关蛋白表达的影响和其可能作用的分子机制.结果显示,TClC-L对SMMC7721细胞生长有显著的抑制作用,显示出剂量和时间的依赖性关系; TClC-L能够显著地降低SMMC7721细胞的迁移能力,促进其凋亡; TClC-L显著上调抑制肝癌细胞生长和诱导癌细胞凋亡的相关蛋白因子Bax、Caspase-3、PARP和迁移抑制因子E-cadherin蛋白的表达水平,下调促进细胞生长和迁移以及抗凋亡的相关蛋白因子Bcl-2、HGF、cMet、NF-κB、MMP9、VEGFR2、c-Myc蛋白的表达水平. TClC-L抑制人肝癌细胞SMMC7721的生长和迁移作用的分子机制涉及到HGF/c-Met/VEGFR-NF-κB信号通路.     

RRP15过表达对核糖体生物发生和细胞增殖的影响

为了明确核糖体RNA加工蛋白15(RRP15)在肿瘤发生发展中的作用,通过构建稳定过表达RRP15的HeLa细胞株HeLa-Flag RRP15及其对照细胞株HeLa-Flag,利用细胞免疫荧光、蛋白免疫印迹等方法研究了RRP15过表达对核仁结构的影响,利用蔗糖密度梯度离心法提取核糖体大小亚基前体,探究了RRP15过表达对核糖体生物发生的影响,利用MTT实验和蛋白免疫印迹检测了RRP15过表达对细胞生长增殖的影响.结果发现,RRP15过表达使细胞核仁数量增多,核仁蛋白表达量上调,核糖体大小亚基前体生物发生水平均有提高,细胞生长增殖速率加快,细胞周期相关蛋白的表达增加.由此认为,RRP15可能通过增加核仁数量和提高核糖体生物发生水平增强细胞的增殖能力,进而促进肿瘤的发生与发展.     

核糖体蛋白RPL15多克隆抗体的制备与细胞内定位

为了解核糖体大亚基蛋白RPL15在细胞中的定位和功能,设计并合成了RPL15蛋白的多肽,作用于抗原免疫兔子,使其产生特异性多克隆抗体,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光方法检测RPL15抗体的特异性.结果证实本研究成功制备并纯化了RPL15的多克隆抗体,且该抗体可以特异性识别RPL15蛋白.免疫荧光实验表明RPL15定位于细胞质和细胞核中,主要定位于核仁并呈点状分布,且与UBF、FBL和C23存在部分共定位.     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri的构建及鉴定

构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-c1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础.用亚克隆法,将目的片段egfp-c1-hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上,用酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,用800 mg/L G418筛选2周后,在荧光显微镜下检测其表达.双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆,荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达.成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX-EGFP-C1-hri.     

重楼活性单体PP-26抑制结肠癌SW620细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的:探讨重楼活性单体PP-26对人结肠癌SW620细胞增殖抑制作用及其机制.方法:采用噻唑蓝(MTT)法和克隆形成抑制实验观察不同浓度的重楼单体PP-26对人结肠癌SW620细胞增殖抑制作用;PI单染及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡水平;Western blotting检测PP-26对细胞周期、细胞凋亡相关蛋白以及Akt和ERK蛋白的表达.结果:与正常肝LO2细胞相比,重楼单体PP-26能显著抑制SW620细胞的生长,作用呈剂量-效应关系;随着PP-26浓度的增加,细胞克隆形成逐渐减少,与细胞对照组相比有显著差异;不同浓度PP-26作用后,细胞阻滞于G1期;PP-26作用细胞24 h后,CDK4、CDK6表达下降,P15、cyclin D1表达增加;不同浓度PP-26作用后,细胞晚期凋亡率增加,随浓度增加有上升趋势;PP-26作用细胞24 h后,线粒体相关凋亡信号通路蛋白Caspase-9、Caspase-3表达下降,PARP切割条带增加,细胞促凋亡蛋白Bax的表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x L减少,p-Akt和p-ERK蛋白表达均下降.结论:重楼活性单体PP-26通过上调p15促进结肠癌SW620细胞阻滞于G1期,通过抑制P13K/Akt信号通路及ERK信号通路,活化线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡.     

核糖体蛋白S3表达减少对果蝇发育的影响

为探讨核糖体蛋白S3在果蝇(Drosophila)发育中的作用,采用RNAi法,分别在果蝇和果蝇S2细胞中干扰核糖体蛋白S3表达,观察对果蝇表型的影响。结果显示,减少核糖体蛋白S3表达引起果蝇幼虫发育延迟,眼睛、翅膀和刚毛生长缺陷等。进一步实验表明,在翅原基中有明显的凋亡信号;S2细胞数目减少;细胞凋亡和细胞周期相关基因表达异常。上述结果暗示核糖体蛋白S3表达减少导致的果蝇发育改变可能通过细胞凋亡的方式来实现。
     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNOX-EGFP-C1-hri的构建及鉴定

构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX—EGFP-c1-hri，为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础．用亚克隆法，将目的片段egfp-c1—hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上，用酶切筛选得到阳性克隆后，用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中，用800mg／L G418筛选2周后，在荧光显微镜下检测其表达．双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆，荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达．成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX—EGFP-C1-hri．     

核糖体蛋白S3表达减少对果蝇发育的影响

为探讨核糖体蛋白S3在果蝇（Drosophila）发育中的作用,采用RNAi法,分别在果蝇和果蝇s2细胞中干扰核糖体蛋白S3表达,观察对果蝇表型的影响。结果显示,减少核糖体蛋白S3表达引起果蝇幼虫发育延迟,眼睛、翅膀和刚毛生长缺陷等。进一步实验表明,在翅原基中有明显的凋亡信号;S2细胞数目减少;细胞凋亡和细胞周期相关基因表达异常。上述结果暗示核糖体蛋白s3丧达减少导致的果蝇发育改变可能通过细胞凋亡的方式来实现。     

异甘草素诱导小鼠黑色素瘤B16F0细胞凋亡的研究

为探讨异甘草素对小鼠黑色素瘤B16F0细胞诱导凋亡的影响。采用SRB法检测异甘草素对B16F0细胞增殖的影响;台盼蓝拒染法检测细胞致死率;吖啶橙/溴乙啶荧光染色法观察细胞凋亡形态;AO/EB和Hoechst 33258染色观察药物处理后细胞形态的变化;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染发检测细胞凋亡率;caspase-9/3试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶-9和半胱氨酸蛋白酶-3的活性;QPCR法检测细胞凋亡相关基因B淋巴细胞-2,Bcl-2相关X蛋白的m RNA表达。结果显示,异甘草素能有效抑制B16F0细胞增殖,呈现浓度依赖性和时间依赖性,作用于B16F0细胞后呈现出明显的凋亡形态,同时随着异甘草素浓度的增加(0、24、45、65μg/m L),细胞凋亡率增加;caspase-9,caspase-3活性逐渐升高;Bax/Bcl-2比率上调(P0.05或P0.01)。由此可知,异甘草素能够显著诱导小鼠黑色素瘤B16F0细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。     

Effects of Genistein on Cell Cycle and Apoptosis of Two Murine Melanoma Cell Lines

The effects of genistein on several tumor cell lines were investigated to study the effects of gen- istein on cell growth, cell cycle, and apoptosis of two murine melanoma cell lines, B16 and K1735M2. These two closely related murine melanoma cell lines, however, have different responses to the genistein treat- ment. Genistein inhibits the growth of both the B16 and K1735M2 cell lines and arrests the growth at the G2/M phase. After treatment with 60 μmol/L genistein for 72 h, apoptosis and caspase activities were de- tected in B16 cells, while such effects were not found in K1735M2. Further tests showed that after genistein treatment the protein content and mRNA levels of p53 increased in B16, but remained the same in K1735M2. The protein content and mRNA levels of p21WAF1/CIP1 increased in both cell lines after treatment. The results show that genistein might induce apoptosis in B16 cells by damaging the DNA, inhibiting topoi- somerase II, increasing p53 expression, releasing cytochrome c from the mitochondria, and activating the caspases which will lead to apoptosis.     

Expression of aquaporin-1 in SMMC-7221 liver carcinoma cells promotes cell migration

Aquaporins (AQPs) are membrane water channels that play pivotal roles in physiological and pathophysi- ological processes in diverse mammalian organs[1―3]. Recent studies indicated a novel role of AQPs in cell migration. Mice lacking AQP1, the endothelia…     

南蛇藤醇介导的 PTEN 过表达增强顺铂对食管癌细胞的化学敏感性并抑制裸鼠成瘤能力

摘要:目的 探究南蛇藤醇介导的 PTEN 过表达对食管癌细胞化学敏感性的影响。 方法 构建食管癌肿瘤模型小鼠,使用南蛇藤醇(1、5 mg / kg)和顺铂(5 mg / kg)单独或联合对其进行瘤内治疗,观察其肿瘤体积变化和检测 30 d时肿瘤质量;免疫组化检测 Ki67,VEGF 和 Caspase 3 的表达情况。 用不同剂量的南蛇藤醇( 0. 5、1、2. 5、5、10、20、50、80、100 μmol / L)处理人食管上皮细胞系( HET-1 A) 24 h,CCK8 分析检测细胞存活率。 顺铂( 4 μg / mL) 预处理EC109 / DDP 细胞后分别用不同剂量的南蛇藤醇( 1、2. 5、5 μmol / L) 处理 EC109 / DDP 细胞,对照组用 PBS 代替顺铂,CCK8 检测细胞存活率;Transwell 检测细胞的侵袭情况,Western blot 检测细胞中 EMT 相关蛋白以及凋亡相关蛋白表达情况,Hoechst 染色检测细胞调亡情况。 结果 南蛇藤醇 1 mg / kg 和 5 mg / kg 处理后的食管癌肿瘤模型小鼠体内肿瘤质量和体积均显著降低( P< 0. 05) ;PTEN 蛋白表达水平显著升高( P< 0. 05) ;Ki67,VEGF 和 Caspase 3 阳性细胞数均显著减少( P<0. 05) 。 用南蛇藤醇(1、2. 5、5 μmol / L) 处理后,与对照组比较,EC109 细胞存活率和侵袭力均显著降低( P<0. 05) ; Ki67、PCNA、N-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达水平显著降低( P<0. 05) ;E-cadherin、cleavedPARP 和 cleaved caspase 3 蛋白表达水平以及细胞凋亡率显著升高( P< 0. 05) ;干扰 PTEN 后细胞存活率以及侵袭力显著升高( P<0. 05) ;凋亡率显著降低( P<0. 05) 。 结论 南蛇藤醇介导的 PTEN 过表达增强顺铂对食管癌细胞EC109 生长、侵袭和 EMT 的抑制作用,促进顺铂诱导的食管癌细胞 EC109 凋亡,从而增强顺铂对食管癌细胞的化学敏感性。     

As4S4诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及相关分子机制研究

研究AS4S4对宫颈癌Hela细胞生长抑制厦诱导凋亡作用，并探讨可能的分子机制。以不同浓度的AS4S4分不同时间段处理Hela细胞，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞增殖抑制率；采用流式细胞术测定细胞凋亡；Western blotting测凋亡相关蛋白Bcl-2，Caspase3表达的变化。结果表明，经AS4S4处理的Hela细胞，增殖受到抑制，作用呈明显的时效和量效关系，细胞凋亡率明显增高并呈浓度依赖性；Western blotting示Bcl-2表达下降，Caspase3表达增加。因此，AS4S4对Hela细胞具有增殖抑制和诱导凋亡作用，其机制与下调Bcl-2蛋白、上调Caspase3蛋白表达有关。     

5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮抑制人乳腺癌细胞生长和诱导凋亡的作用

目的 探讨金雀异黄素（Genistein,Gen）衍生物5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮（5,4’-Di-n- octoxyl-7-gem-difluoromethylene-genistein,DOdFMG）体外抑制人乳腺癌细胞系MCF-7细胞生长和诱导凋亡作用及机制,以寻找具有开发前景的肿瘤治疗新候选药物.方法 体外培养人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞,分别应用不同浓度的DOdFMG处理人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞,软琼脂克隆形成法测定DOdFMG对体外培养MCF-7细胞的锚定非依赖性增殖及生长作用的影响;PI染色流式细胞计分析（FCM）法检测DOdFMG对MCF-7细胞诱导凋亡影响.western blotting法检测蛋白激酶CK2,NF-KB蛋白表达和活性的变化,初步探讨DOdFMG抗乳腺癌作用的分子机制.结果 DOdFMG对体外培养MCF-7细胞具有抑制增殖及生长作用,呈剂量依赖性.DOdFMG诱导人MCF-7细胞凋亡.Western Blot分析结果显示：DOdFMG 3.0,10.0,30.0 μmol/L处理人乳腺癌MCF-7细胞24 h后,比较于空白对照组,蛋白激酶CK2的表达下调12.50%,41.50%,67.30%,NF-KB的表达下调20.50%,51.47%,71.93%.DOdFMG 30.0 μmol/L分别处理6,12,24 h后,比较于空白对照组,蛋白激酶CK2的表达下调27.73％,44.8％,65.2％,NF-KB的表达下调20.50%,49.83%,69.93%.这表明DOdFMG以时间－剂量依赖方式引起蛋白激酶CK2、NF-KB下调,与先导化合物Gen比较,DOdFMG更为有效（P<0.05）.结论 DOdFMG显著抑制人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞增殖及生长;DOdFMG可诱导人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞凋亡;抑制蛋白激酶CK2,下调NF-κB的表达可能是DOdFMG诱导凋亡的分子机制之一.     

枸杞叶中总黄酮对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

研究枸杞叶中总黄酮对体外培养的人肝癌细胞HepG2增殖抑制及其细胞凋亡的影响.用不同质量浓度的枸杞叶总黄酮作用于体外培养的人肝癌细胞HepG2,用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测HepG2细胞存活率,通过Hoechst33258染色法、AV/PI双染流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况,利用免疫细胞化学法、Western blot方法分析枸杞叶中总黄酮对HepG2细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3表达的影响.结果表明,枸杞叶中总黄酮分别作用于人肝癌细胞HepG2 48,72h均可明显抑制其增殖,并呈现显著的时间、剂量依赖性.高质量浓度枸杞叶总黄酮作用人肝癌细胞HepG2 48h后,HepG2细胞呈现出典型的细胞凋亡特征,凋亡率达67.3%.枸杞叶总黄酮作用于HepG2细胞一定时间后,可引起促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达上调.枸杞叶中总黄酮可明显抑制人肝癌细胞HepG2增殖和诱导细胞凋亡,其作用机制可能是通过有效上调促凋亡蛋白Bax,破坏细胞内稳态环境,继而激活凋亡蛋白Caspase-3,最终引发人肝癌细胞HepG2凋亡.     

抑癌基因p27在肿瘤细胞MCF7中的表达

抑癌基因p27是一个细胞周期依赖性激酶抑制子CKI(CDK inhibitor),对细胞周期起着负调控的作用,将p27基因克隆到表达载体pcDNA,转染到肿瘤细胞MCF7中,筛选到稳定表达株．p27基因的过量表达确实对肿瘤细胞的生长产生了抑制作用,并且引发了部分肿瘤细胞的凋亡．     

云芝多糖影响人宫颈癌HeLa细胞的增殖和凋亡的研究

研究云芝多糖(CVP)对宫颈癌HeLa细胞系的增殖、凋亡及产生途径。采用MTT法测定了CVP对HeLa细胞增殖的体外抑制作用,流式细胞仪检测凋亡细胞的比例,qRT-PCR检测P53、Bcl-2和Fas基因在细胞处理前后表达量的变化。结果显示：CVP以时间和剂量依赖的方式抑制HeLa细胞的生长。作用时间在24 h,48 h和72 h时对细胞抑制的抑制率分别为92%、95%和98%;当CVP浓度达到1.25 mg/L时,作用24 h、48 h和72 h时的IC50值分别为0.2507±0.01 mg/L、0.2720±0.04 mg/L和0.2736±0.03 mg/L;当CVP浓度为0.5 mg/L时,作用24 h和48 h后细胞凋亡率分别为26.36% 和63.81%;CVP处理HeLa细胞24 h后,Bcl-2基因的表达被显著下调。研究表明：CVP促进HeLa细胞凋亡,其作用机制与Bcl-2基因的表达下调有关,推测是通过Bcl-2介导的途径促进细胞凋亡。图4表1参30     

芒果多酚对宫颈癌Hela细胞的抑制作用及机制

用芒果多酚处理人宫颈癌细胞(Hela)后,采用MTT法检测细胞的存活率;Hoechst 33258荧光染色和流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布,同时用Western blot检测p53,p21,c-myc,cyclin D1蛋白质水平变化.结果显示：0.025,0.05, 0.1,0.2,0.4 mg/mL的芒果多酚溶液能明显抑制Hela细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性;荧光染色后,大多数细胞内可以看见浓密的荧光颗粒,并出现核收缩;流式细胞术分析发现,与未处理组比较,芒果多酚作用后的G1期Hela细胞数显著增多,G2期细胞数逐渐减少;凋亡率明显高于对照组;Western blot检测显示芒果多酚上调p53,p21蛋白水平,下调c-myc,cyclin D1蛋白水平. 以上结果表明芒果多酚能明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖,诱导其凋亡.     

CPUY013对胰腺癌Capan2的生长抑制与诱导凋亡作用

探讨CPUY013对体外培养人胰腺癌细胞Capan2生长抑制及诱导凋亡作用.采用MTT法、克隆原形成法检测CPUY013对Capan2细胞生长的抑制作用,采用流式细胞仪分析CPUY013对细胞周期的影响,Western Blot法检测TopoⅠ、野生型p53、caspase-3、bcl-2和bax蛋白表达的变化.MTT法、集落形成试验结果显示,CPUY013对体外培养的人胰腺癌细胞Capan2有明显的生长抑制作用,处理72 h的IC50值为7.3×10^-7mol/L（MTT法）,CPUY013在8.0×10^-8mol/L浓度可以明显抑制Ca-pan2细胞的集落形成,抑制率为69.6%.同时,CPUY013可剂量依赖地降低Capan2细胞G1期细胞的比例,升高S期细胞的比例,呈现明显的S期阻滞.CPUY013可下调TopoⅠ蛋白的表达,上调细胞中p53、caspase-3、bax蛋白表达,下调bcl-2蛋白表达,并呈剂量依赖性.CPUY013对Capan2细胞具有明显的生长抑制作用,阻滞细胞周期进程,诱导Capan2细胞凋亡,其可能与降低细胞内TopoⅠ蛋白表达,增加p53、caspase-3、bax蛋白表达,降低bcl-2蛋白表达有关.