爱玉ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子试验和正交设计,对影响爱玉ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度、延伸时间和循环次数等指标进行优化.实验确立了可用于爱玉ISSR-PCR分析最适宜的反应体系：20 μL反应体积中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs;PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸2.5 min,共35个循环;72 ℃延伸7min,4 ℃保存.应用该体系对14份爱玉种质进行扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

海南普通野生稻ISSR-PCR反应体系的优化

通过不同浓度的Mg2+、模板DNA、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度和循环次数的单因素试验,筛选海南普通野生稻最佳ISSR-PCR反应体系为:15μl反应体系中含2.0 mmol/L MgCl2,50 ng模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.20 U Taq酶,1.5μmol/L ISSR引物,50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3).反应程序:94℃预变性5 min;94℃,1 min,52℃,1 min,72℃,2 min,35个循环;72℃延伸10min,4℃保存.     

草地早熟禾ISSR-PCR反应体系优化

采用正交设计和单因子试验结合的方法,优化适合于草地早熟禾的ISSR体系。对影响ISSR-PCR的多个因素,包括MgCl2、dNTP、Primer、TaqE的浓度和用量进行优化,同时,对DNA模板浓度、引物退火温度进行筛选。确定草地早熟禾的最佳ISSR-PCR反应体系为：94℃预变性5min,94℃变性30 s,Tm值退火45 s,72℃延伸90 s,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存;20μL反应体系包括2μL10×Buffer,0.96μL dNTP（2.5×10^-3mol.L^-1）,1μL Primer（1.0×10^-5mol.L^-1）,0.2μL Taq酶（5 U.μL^-1）,1μL Template DNA,14.84μL H2O。     

流苏石斛ISSR-PCR反应体系的优化

以流苏石斛为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合流苏石斛ISSR-PCR分析的最佳反应体系.在20μL反应体系中含1×buffer,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 mmol/L dNTP s,1.0μmol/L引物,0.5 UTaqDNA聚合酶,10 ng模板DNA.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸45 s,共35个循环;最后72℃延伸7 min.     

干用辣椒RAPD—PCR反应体系正交优化的研究

以干用辣椒幼苗为材料,研究了干用辣椒RAPD分析过程中的Taq酶、Mg^2＋,dNTPs、引物、模板DNA浓度、退火温度等影响因素,建立适合干用辣椒RAPD反应的PCR体系,即25μL反应体系中含有解体Taq酶1．5U、Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0．6mmol／L、引物0．8μmol／L、模板DNA60ng．扩增程序为：94℃预变性4min;94℃变性1min,37℃退火1min,72％延伸1．5min,40个循环;最后72℃副延伸5min．     

正交设计优化太子参ISSR-PCR反应体系

利用正交设计实验对影响太子参ISSR-PCR扩增的重要因素(d NTPs、引物、Taq酶、模板DNA浓度)进行优化,以建立太子参ISSR-PCR的优化反应的最佳体系,25μL反应体系中包含d NTPs300μmol/L,引物500nmol/L,Taq酶1U及模板DNA 50ng.适宜的扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性40s,46℃退火45s,72℃延伸2min,41次循环;最后于72℃延伸7min,4℃进行保存.该正交体系的建立,将为太子参种质资源鉴定及遗传多样性的研究提供技术支持.     

华山松ISSR反应体系的优化

为获得条带清晰、稳定和多态性高的华山松ISSR扩增结果,对引物、Mg~(2+)浓度和退火温度等因素进行了优化.确定了ISSR分析的最佳PCR条件:15μL反应体系中,10×PCR buffer反应缓冲液1.5μL,模板DNA 22.5 ng,Mg~(2+)2.2 mmol/L,d NTPs 0.23 mmol/L,引物0.93μmol/L,Taq DNA聚合酶0.027 U/μL.PCR反应程序为:经94℃预变性4min后,经过94℃变性30 s,Tm-4.8℃退火30 s,72℃延伸108 s共33个循环;循环结束后72℃延伸10 min.从44条ISSR引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.对华山松ISSR实验优化体系的建立,为今后利用ISSR分子标记技术开展华山松种间遗传变异分析和构建遗传图谱等研究奠定了基础.     

新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增体系的优化

以3个新疆杏品种的叶片为试材,以其叶片基因组DNA为模板,分别对PCR扩增体系中的10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、TaqDNA聚合酶和退火温度5个因素设计6个梯度,研究了新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增条件,建立其优化的PCR扩增体系。研究结果表明:其扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸2min,35个循环后72℃延伸10min,25μL反应体系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP0.08mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA80ng,DNA聚合酶1μL,此为最优的反应体系。     

三角梅ISSR反应体系的建立和优化

对影响三角梅ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合三角梅的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μL,其中10×buffer(含Mg2+)2.0μL,dNTP250μmol/L,Taq酶1.0U,引物0.3μmol/L,模板DNA20ng。扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,51.6℃退火1min,72℃延伸2min,34个循环;最后72℃延伸7min。该反应体系标记点位清晰、稳定、重复性好,适宜三角梅ISSR分析,为应用ISSR技术鉴定三角梅种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

均匀设计优化黑木相思ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响黑木相思ISSR-PCR体系的引物、Mg2 、dNTP、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行5因素5水平和5因素3水平两轮优化,建立了适合于黑木相思ISSR-PCR的体系:在20μL反应体系中,含引物0.30μmol.L-1,Mg2 3.00 mmol.L-1,dNTP 0.15 mmol.L-1,Taq DNA聚合酶0.75U,模板DNA 2.00 ng.μL-1.在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度、退火时间进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性5 min;接着进行33个循环:94℃变性35 s,52~61.5℃退火52 s,72℃延伸90 s;循环结束后,72℃延伸10 min.同时筛选得到10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.