复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性（英文）

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12~127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5%的α-螺旋,30%的β-折叠和65%的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12～127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5％的α-螺旋,30％的β-折叠和65％的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

小鼠巨噬细胞中microRNA-155促进急性心肌梗死后心室重构的作用机制

为探究巨噬细胞中microRNA-155(miR-155)表达水平对急性心肌梗死(AMI)后心室重构的影响及其机制,将miR-155基因过表达(miR-155+/+)和基因敲除(miR-155-/-)小鼠的骨髓细胞分别移植给野生型(WT)小鼠进行血液重建,并建立AMI模型,检测血浆及心肌组织中炎症因子TNF-α和IL-10的表达水平,评价小鼠心脏功能并观察巨噬细胞浸润、心室重构的情况,进而利用病毒包装技术敲降细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1)基因后验证其作为miR-155靶基因的影响.结果显示:miR-155+/+组较miR-155-/-组小鼠的心脏收缩功能显著受限(p0.01);巨噬细胞中miR-155表达水平显著影响血浆中炎症因子的释放(p0.01),并促进心室重构的发生(p0.01);miR-155表达水平与SOCS1的mRNA及蛋白质表达水平呈显著负相关(p0.01).综上可知,抑制AMI后巨噬细胞中miR-155的表达可以促进靶基因SOCS1的表达,从而减轻AMI后的炎症反应,有利于减轻心室重构.     

miR-146a在肺泡Ⅱ型上皮细胞抗结核分枝杆菌感染中的免疫调控作用

利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法分析了强毒株人型结核分枝杆菌H37Rv和减毒株卡介苗(BCG)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)株A549中微小RNA-146a (miR-146a)的表达情况;构建miR-146a腺病毒过表达载体,分析在结核分枝杆菌(Mtb)感染A549细胞中,过表达miR-146a对toll样受体(TLRs)信号通路及炎症因子的表达调控作用.结果表明, Mtb感染可引起A549细胞中miR-146a表达上调;当在A549细胞中过表达miR-146a时,在BCG感染组中TLR2的表达表现为感染后显著抑制, H37Rv感染组中TLR2表达差异不显著; TLR4在BCG和H37Rv感染组中均表现为显著下调.过表达miR-146a时,在BCG和H37Rv感染组中对TLR信号通路的下游分子髓样分化因子(MyD88)、TNF受体关联因子6 (TRAF6)、核因子κB (NF-κB)和促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6的表达均表现为感染后的抑制作用,而IL-8表达影响不明显.说明在AECⅡ细胞抗Mtb感染过程中, miR-146a负调控TLRs信号通路中MyD88、TRAF6、NF-κB和IL-6等来调控AECⅡ细胞对Mtb的感染过程.     

MiR-17促进胃癌细胞上皮间质转化机制

目的 探讨miR-17调控胃癌细胞上皮间质转化的作用机制.方法 检测胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17的表达水平;分别将miR-17模拟物(抑制物)和TGFBR2过表达载体(siRNA)转染到SGC-7901胃癌细胞中,通过MTT法、流式细胞术、Transwell实验和Western blotting检测细胞增殖、凋亡、侵袭和EMT标志蛋白表达;荧光素酶报告基因分析验证miR-17与TGFBR2的靶向关系.结果 胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17表达上调;过表达miR-17促进SGC-7901细胞增殖、侵袭,抑制凋亡;miR-17靶向TGFBR2的3'UTR;过表达TGFBR2抑制SGC-7901细胞增殖、侵袭,促进凋亡;miR-17通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路促进SGC-7901细胞EMT.结论 miR-17靶向下调TGFBR2表达,激活PTEN/PDK/AKT信号通路,促进SGC-7901细胞EMT.体内研究结果证明miR-17促进肿瘤的生长.因此,miR-17可能是胃癌抗转移治疗的潜在策略.     

miR-143-3p通过调节TGIF2的表达在甲状腺癌中的作用研究

目的 探究过表达 miR-143-3p 对甲状腺癌( thyroid cancer,TC) 细胞的影响及其作用机制。 方法 Real-time PCR 分析正常甲状腺上皮细胞和不同 TC 细胞中 miR-143-3p 的表达。 Targetscan 网站和双荧光素酶报告系统验证miR-143-3p 和 TGIF2 3′UTR 的靶向关系;Real-time PCR 检测 miR-143-3p 和 TGIF2 mRNA 的过表达效率;过表达成功后,将 CAL-62 细胞分为对照组、miR-143-3p mimic 组、pcDNA-TGIF2 组和 miR-143-3p+TGIF2 组,ELISA 检测细胞上清液中诱导型一氧化氮合酶( iNOS) 、白细胞介素( IL) -1β 和 IL-6 的含量;试剂盒检测超氧化物歧化酶( SOD) 水平,免疫荧光检测活性氧( ROS)产生;显微观察干细胞成球,Western blot 检测 TGIF2、p-P65、富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体5 ( LGR5) 和 八聚体结合蛋白4 ( OCT4 ) 蛋 白 表 达。体内构建裸鼠移植瘤, 检测过表达miR-143-3p 对肿瘤生长的影响。 结果 miR-143-3p 在 TC 细胞中的表达明显低于正常甲状腺上皮细胞( P< 0. 05) 。Targetscan 网站和双荧光素酶报告系统证实 miR-143-3p 与 TGIF2 存在靶向关系。 miR-143-3p mimic 组 miR-143-3p的表达上调( P<0. 05) ,TGIF2 mRNA 和蛋白表达下调( P<0. 05) ,iNOS、IL-1β 和 IL-6 含量明显降低( P<0. 05) ,抗氧化能力显著下降 ( P < 0. 05) , 干 细 胞 成 球 能 力 降 低 ( P < 0. 05) , p-P65、 LGR5 和 OCT4 的蛋白表达均显著下调( P<0. 05) 。 pcDNA-TGIF2 组的结果相反,过表达 miR-143-3p 能显著抑制 pcDNA-TGIF2 的促癌作用。 裸鼠移植瘤模型表明过表达 miR-143-3p 能够减小肿瘤的质量和体积,下调瘤组织中 TGIF2 和 OCT4 的表达( P<0. 05) 。 结论过表达 miR-143-3p 能够通过下调 TGIF2 的表达抑制 TC 细胞促炎因子水平、抗氧化能力和干细胞样特性,并抑制裸鼠肿瘤的形成。     

杨树GABA支路3个基因家族的鉴定和表达分析

【目的】 γ-氨基丁酸(GABA)与植物的生长发育有着密切的联系。结合前期对GABA抑制杨树不定根发育的研究,对GABA支路基因家族的特征和表达模式进行研究,为进一步解释其在不定根发育中的作用奠定基础。【方法】从银白杨(Populus alba)×P. glandulosa ‘84K’(‘84K’杨)基因组中鉴定出GABA支路的PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员,并利用生物信息学方法分析其特征,以及与其他物种相关基因家族的亲缘关系;利用qRT-PCR研究外源GABA及其降解抑制剂vigabatrin(VGB)对各基因表达的影响。【结果】①PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员数量依次为6、2和2个,启动子序列中主要包含与光、激素和环境等响应相关元件。②系统进化分析表明,PopGAD家族中PopGAD6与家族其他成员亲缘关系较远;PopGABA-T和PopSSADH家族中的两个基因成员亲缘关系较近。③基因表达分析表明,不定根生长过程中GABA支路基因总体上在根中表达量高于茎和叶。外源GABA或VGB处理对PopGAD和PopGABA-T两个基因家族成员在根、茎和叶中的表达量影响程度不同,但对 PopSSADH基因家族的表达则无明显影响。【结论】 GABA支路3个基因家族在‘84K’杨树响应光、激素和环境胁迫等方面具有重要作用。外源GABA和VGB处理对PopGAD和PopGABA-T家族成员的影响较大,并且均在根中表达量最高,表明这两个基因家族在不定根生长过程中发挥着重要调控功能。这为深入解析GABA在树木不定根发生中的作用机制奠定了基础。     

榛子SBP基因家族鉴定及其系统进化和表达分析

SBP蛋白是植物所特有的一类转录因子,并广泛存在于植物中.研究发现,该基因家族成员参与响应包括植物生长、发育和抗逆等生物学过程,其功能研究具有重要意义.榛子是一种主要以果实为产品的重要经济林木,且该物种SBP基因家族的研究也未见报道.本研究以生物信息学手段为基础,结合转录组数据,从中筛选得到10个榛子SBP-like基因(SPL基因),并对其编码蛋白理化性质、保守区域和模体进行预测和分析,进而对基因家族进化关系和花发育不同时期表达水平进行了分析.结果表明:榛子的10个SPL基因可以分为5个大组群;均含有该基因家族所特有的C3H和C2CH结构域以及一个核定位信号;同时,基于花发育不同时期的转录组数据分析,部分成员在不同时期表达水平存在显著差异,预示该基因可能与花果发育有关.该研究将有助于榛子SPL基因参与其花果发育分子调控机制的深入研究.     

miR-34a靶向MMP-13调控大鼠软骨细胞凋亡的机制

目的:探讨调控miR-34a的表达对大鼠软骨细胞凋亡的影响.方法:大鼠关节软骨原代细胞培养,慢病毒转染miR-34a、miR-34a inhibitor分别使大鼠关节软骨细胞miR-34a过表达和抑制表达,另设无关序列对照组,Annexin V/PI双染流式细胞术分析对比各组大鼠软骨细胞凋亡率,通过生物信息学方法预测miR-34a调控软骨细胞凋亡潜在基因靶点,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time-PCR)检测各组软骨细胞miR-34a的表达,检测软骨凋亡相关因子MMP-13、Col2a1的mRNA转录水平;免疫印迹法检测各组的MMP-13、Col2a1、caspase-3的蛋白表达水平.结果:miR-34a过表达后大鼠软骨细胞凋亡增多,抑制miR-34a表达后大鼠软骨细胞凋亡减少,同时miR-34a过表达后caspase-3的表达增高(P0.05),miR-34a过表达后Col2a1在mRNA和蛋白水平表达下降,而MMP-13的表达增加(P0.05).沉默miR-34a的表达后Col2a1在mRNA和蛋白水平表达增加,而MMP-13的表达下降.MMP-13是miR-34a调控大鼠软骨细胞凋亡的潜在靶点.结论:miR-34a的表达调控大鼠软骨细胞凋亡,MMP-13是miR-34a其机制中的潜在靶点.     

积雪草苷调控miR-342-5p/AQP3轴保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤

目的 探讨积雪草昔(Ass)对白细胞介素1B(IL-1B)诱导的软骨细胞损伤的影响及作用机制。方法 不同 浓度的Ass作用IL-1B诱导软骨细胞24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中白细 胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-342-5p和水通道蛋白3 (AQP3)mRNA表达水平,Western Blot法检测B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)和AQP3蛋 白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-342-5p与AQP3靶向关系。转染miR-342-5p抑制剂或AQP3过表达载体至软骨细胞,上述相同方法检测抑制miR-342-5p表达或AQP3过表达对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及IL- 6和TNF-α表达的影响。结果 Ass可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达及miR- 342-5p表达(P <0. 05),促进Bcl-2蛋白、AQP3 mRNA和蛋白表达(P <0.05)。miR-342-5p在软骨细胞中负调控 AQP3表达。抑制miR-342-5p或AQP3过表达后,IL-1&诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达降低 (P <0. 05) ,Bcl-2蛋白表达升高(P <0.05)。抑制AQP3表达逆转了抑制miR-342-5p对IL-1β诱导的软骨细胞凋 亡、Bax和Bcl-2蛋白及IL-6和TNF-α表达的影响。结论 Ass可抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡和炎症反应,其可 能通过调控miR-342-5p/AQP3保护软骨细胞损伤。     

家族性和三阴性乳腺癌血清中miR-21的表达

目的:检测血清miR-21在乳腺癌中的表达差异,为进一步阐明miR-21在家族性和三阴性乳腺癌发病机制中的作用.方法:收集健康女性体检者、具有患乳腺癌高风险者、不同种类乳腺癌患者的血清.以线虫miR-39为外参,通过实时荧光定量PCR检测77份血清中miR-21的表达水平.结果:家族性乳腺癌组、三阴性乳腺癌组和乳腺癌高风险组血清miR-21水平显著高于正常对照组、其他乳腺癌组(P0.01).血清miR-21的表达水平与淋巴结转移、Ki67高表达有关(P0.01).结果显示血清miR-21表达量在家族性和三阴性乳腺癌中升高,且与淋巴结转移和Ki67表达有关.结论:血清miR-21与三阴性、家族性乳腺癌的发生有紧密联系,其表达增高与乳腺癌的遗传性、恶性程度及预后判断有关.     

拟南芥MtN3/saliva基因家族分析

MtN3/saliva基因家族是含有2个MtN3/saliva跨膜结构域的膜整合蛋白,其成员广泛存在于真核生物中.目前对该家族功能研究较少,对其跨膜结构域的分子功能还不清楚.在拟南芥中该家族有18个成员,除了最近克隆的RPGl以外其他MtN3/saliva基因的功能均不清楚.对拟南芥MtN3/saliva基因家族进行了较为全面的分析,包括基因结构、染色体分布、蛋白结构域、系统进化关系、基因表达谱等.对其中预测在花药中高表达的4个基因进行了实时定量PCR分析,证实有3个基因在花中高效表达.这些结果促进了对MtN3/saliva基因家族的深入了解.     

p53振子的形成机制及microRNA对p53目标基因表达的精细调控

肿瘤抑制因子p53调控着大量的基因,在肿瘤抑制中起着关键作用.实验结果表明,当DNA受损后,p53的表达呈现周期性振荡.已有的一些p53振子的理论模型,其振子产生机制通常依赖于p53和Mdm2之间相互作用的时滞因素.考虑基因表达的转录和翻译过程,运用动力学方程建模的方法,给出一种新模型,并利用Hopf分叉理论,给出p53振子产生的条件.数值模拟结果表明,与已有的时滞模型相比,该模型对参数具有更好的鲁棒性,较好地解释了p53振子的产生机制.最近的许多实验表明,p53调控着miR-34家族中大量microRNA的表达,这些microRNA又在后转录水平上对p53的下游目标基因起着调控作用.在这一模型基础上,研究microRNA加入p53调控网络后所起的调控作用,数值模拟结果初步表明,microRNA对p53下游目标基因表达起到了精细调控作用.     

钠氢交换调控因子1(NHERF1)的结构与功能

钠氢交换调控因子1是一种由358个氨基酸组成的多功能连接蛋白.其分布位置与表达水平将决定其功能,当其位于细胞膜上,可能表现为一个肿瘤抑制因子;当其处于细胞质中,可能成为致癌蛋白.其功能机制的研究主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和血小板衍生因子(PDGF)、外向整流氯离子通道(ORCC)等信号通路,以及细胞迁移和微丝骨架分布的调控方面.本文对近年来关于NHERF1/EBP50的结构和功能的研究进行了综述.     

干扰长链非编码 RNA NEAT1 上调 miR-126 抑制胃癌细胞的生长、间质转换及裸鼠肿瘤形成

摘要:目的 研究干扰长链非编码 RNA 核富集的转录物 1( NEAT1) 上调 miR-126 抑制胃癌细胞的生长,间质转换及裸鼠肿瘤形成的影响。 方法 通过 RT-PCR 分析 NEAT1 在胃癌 MGC-803、SGC-7901 细胞和正常胃上皮 GES-1细胞中的表达,并检测 sh-NEAT1 的沉默效率。 NEAT1 沉默后,EDU 染色分析肿瘤细胞的增殖能力;流式细胞术分析细胞凋亡;Transwell 小室和划痕实验分析肿瘤细胞的侵袭、迁移能力;Western blot 分析肿瘤细胞 Ki67、Caspase-3、N-cadherin 和 E-cadherin 的表达。 荧光素酶报告实验验证 NEAT1 与 miR-126 的靶向关系,分析 NEAT1 / miR-126 对胃癌 SGC-7901 细胞生长和运动的调节影响;通过构建转染 sh-NEAT1 的 SGC-7901 细胞的移植瘤模型裸鼠,检测30 d 内肿瘤体积及质量变化;免疫组化检测 Ki67 和 Caspase-3 的表达,RT-PCR 检测 NEAT1 和 miR-126 的表达;Western blot 检测 N-钙黏蛋白( N-cadherin) 及 E-钙黏蛋白( E-cadherin) 的表达。 结果 NEAT1 在肿瘤细胞中的表达水平显著高于正常细胞( P< 0. 05) ,sh-NEAT1 沉默后,肿瘤细胞 NEAT1 的表达量显著降低,增殖能力明显受到抑制,凋亡细胞比例显著增高,肿瘤细胞的侵袭、迁移能力明显减弱,肿瘤细胞中 Ki67 和 N-cadherin 表达量明显降低,Caspase-3 和 E-cadherin 的表达水平显著升高,差异均具有统计学意义( P< 0. 05) 。 荧光素酶报告实验表明NEAT1 与 miR-126 存在靶向关系,sh-NEAT1 能显著促进 miR-126 的表达( P< 0. 05) ,miR-126 inhibitor 能显著促进 sh-NEAT1 对 SGC-7901 细胞增殖、侵袭、迁移,并抑制细胞凋亡。 移植瘤模型裸鼠表明 sh-NEAT1 能够抑制肿瘤体积增大,下调肿瘤组织中 NEAT1、Ki67 及 N-cadherin 的表达水平,上调 miR-126、Caspase-3 和 E-cadherin 的表达量,肿瘤的 质 量 与 对 照 组 相 比 显 著 增 加,差 异 均 有 统 计 学 意 义 ( P < 0. 05) 。 结 论 干 扰 长 链 非 编 码 RNANEAT1 能够上调 miR-126 表达,从而抑制胃癌细胞的增殖,并通过阻断 EMT 机制降低肿瘤细胞的侵袭、转移能力,抑制裸鼠肿瘤的形成。     

大鼠中性氨基酸转运蛋白HA-SNAT3融合蛋白的构建和鉴定(英文)

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT3是SLC38基因家族N系统的成员之一,主要在脑部和视网膜的星形胶质细胞中表达,负责转运谷氨酰胺,在脑部和肝脏的谷氨酸-谷氨酰胺循环中发挥重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达和定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接的方法将HA标签连接到质粒pBK-CMVΔ(1098-1300)-SNAT3中大鼠SNAT3的N端,构建了真核生物表达载体pBK-CMVΔ-SNAT3.用脂质体转染法将该表达载体瞬时转染进人胚肾细胞(HEK293T cells),通过Western blotting检测HA-SNAT3融合蛋白的表达.结果表明,HA-SNAT3能够正确在细胞膜上表达.pBK-CMVΔ-SNAT3表达载体的成功构建对于进一步研究SNAT3的结构和功能提供了有效方法.     

miR-194-5p通过Wnt5a抑制肝星状细胞活化

为研究miR-194-5p对肝星状细胞(HSCs)活化的影响及作用机制,采用CCK-8、β-半乳糖苷酶染色、Transwell、划痕、集落形成实验和RT-qPCR、Western blot分别检测miR-194-5p对LX-2细胞生物学特性、细胞活化标志物和靶基因表达的影响,并用生物信息学和双荧光素酶报告实验确定miR-194-5p靶基因.结果显示：miR-194-5p抑制LX-2细胞增殖、细胞集落形成、迁移能力以及LX-2细胞中活化标志物的表达,促进LX-2细胞衰老;Wnt5a为miR-194-5p的直接靶基因.研究表明miR-194-5p通过靶定Wnt5a抑制LX-2细胞活化,miR-194-5p和Wnt5a可能是治疗肝纤维化新的靶点.     

拟南芥、水稻和杨树ACTIN家族全基因组分析

鉴定了覆盖拟南芥、水稻和杨树3种模式植物全基因组的20个拟南芥、18个水稻、22个杨树ACTIN蛋白基因,对其染色体定位、基因结构、基因复制等进行了综合分析.并在系统进化分析基础上,将ACTIN基因家族分为12个亚家族,有助于揭示植物ACTIN基因家族的进化历史,为后续ACTIN基因家族的功能提供线索,对研究植物ACTIN基因家族功能和进化上的多样性提供理论基础.     

miR-26a可通过HGF-cMet信号通路来抑制肿瘤血管生成

复旦大学钦伦秀教授课题组证实一种名为MicroRNA-26a(miR-26a)的miRNA通过靶向HGF-cMet信号通路,抑制了肝癌的血管发生.相关研究论文已被《Hepatology》接受并在线发布.近来有研究发现miR-26a下调与癌症的不良预后存在关联.今年早些时候,钦伦秀课题组证实了肝癌组织中miR-26a往往下调,且与肝癌复发及转移存在相关性.miR-26a可通过IL-6-Stat3信号通路来抑制肿瘤生长及转移.在新研究中,研究人员进一步探讨了miR-26a有可能在肿瘤血管发生中所起     

藜麦CqKEA基因家族的鉴定及表达

运用生物信息学的方法对CqKEA基因家族进行系统分析,结果表明,CqKEA基因家族包含10个成员,通过系统发育分析将其分为三组,同组基因具有相似的基因结构、蛋白motif和功能;部分基因的表达存在显著的组织特异性,并且干旱、高温和盐胁迫也会对部分基因的表达产生影响。对CqKEA基因家族的分析为藜麦耐逆机理研究和分子育种奠定了基础。