结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。     

电针对PCPA致失眠大鼠脾脏TLR7信号通路关键基因mRNA表达的影响

目的:观察电针对对氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠大鼠脾脏Toll样受体7(TLR7)信号通路关键基因mRNA表达的影响,探讨电针治疗失眠的免疫学机制.方法:取健康SPF级Wistar雄性大鼠32只,随机分成空白组、模型组、电针组和安定组,每组8只.模型组以腹腔注射PCPA建立大鼠失眠模型,安定组给予腹腔注射安定,电针组给予电针神门(HT7)、三阴交(SP6)穴位,连续治疗5 d后用实时荧光定量PCR(RT-PCR)反应测定大鼠脾脏TLR7、髓样分化蛋白88(My D88),IL-1受体相关激酶4(IRAK4)、肿瘤坏死因子相关激酶6(TRAF6)、及核因子NF-κB(NF-κB)的mRNA表达.结果:与空白组对照,模型组TLR7、My D88、IRAK4及TRAF6的mRNA表达增加(P0.05);与模型组比较,电针组、安定组IRAK4、TRAF6及NF-k B的mRNA表达降低,电针组TLR7及My D88的mRNA表达降低(P0.05),但电针组与安定组比较,无统计学差异(P0.05).结论:失眠上调TLR7信号转导通路关键基因mRNA表达,TLR7可能参与免疫对睡眠的调节;电针可通过调节TLR7信号转导通路调控相关免疫物质的释放,改善睡眠及减轻失眠对机体带来的损伤.     

多泛素链延伸酶E4B对TLR信号通路的调节作用

研究多泛素链延伸酶E4B对TLR信号通路的影响.在HEK293T细胞中,通过双荧光报告系统检测E4B对TLR信号通路的影响,并且用免疫共沉淀的方法鉴定E4B的相互作用蛋白质.发现多泛素链延伸酶E4B能够抑制TLR通路的下游转录因子NF-κB和IRFs的转录活性,并且能与TRAF6发生相互作用.提示多泛素链延伸酶E4B可能参与TLR信号通路的调控,为TLR信号通路的研究提供新的线索.     

不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞TfR与Lf的表达

为探讨结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株(BCG)分别感染巨噬细胞,检测细胞内转铁蛋白受体和乳铁蛋白表达量并分析其时相性变化及意义。分别采用结核分枝杆菌H37Rv株和BCG菌株感染巨噬细胞RAW264.7细胞株,于感染后1、6、12、18、24h,应用ELISA技术检测巨噬细胞上清液中TfR和Lf的表达量;应用Western blot技术于上述时间点检测巨噬细胞内TfR的表达量。结果显示,ELISA和Western blot技术均证实感染模型组检测的TfR表达量均高于正常对照组,ELISA结果显示上清液中TfR表达量在感染12和18h差异最明显,具有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示:于模型建成后1、6、18h、差异有统计学意义(P<0.05)。另外,ELISA证明感染可诱导巨噬细胞分泌较高水平的Lf,于感染后6、12、18、24h均高于正常对照组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。由此可知,结核分枝杆菌感染导致巨噬细胞内的TfR和Lf表达更高。     

二乙基亚硝胺诱导小鼠肝纤维化动态模型的建立及病理机制初探

摘要:目的 为 探 究 肝 纤 维 化 的 发 生 发 展 机 制 及 病 理 病 因 的 特 点, 本 研 究 通 过 建 立 二 乙 基 亚 硝 胺( diethylnitrosamine,DEN)诱导的肝纤维化动态小鼠模型,动态监测上述小鼠模型的血清生化指标,推断肝纤维化阶段。 方法 雄性 C57BL / 6 小鼠按梯度剂量每周 2 次腹腔注射 DEN,连续 8 周。 分别在第 2、4、6 和 8 周收集小鼠的血清和肝组织,通过检测相应血清生化指标、肝组织羟脯氨酸含量以及组织病理学检查监测和评估小鼠肝纤维化的发病进程。 采用 Western blot 检测 TGF-β1、α-SMA 和 TLR4 / MyD88 / NF-κB 信号通路相关蛋白以探究肝纤维化的发病机制。 结果 从第 4 周开始,与 对 照 组 相 比, DEN 诱 导 小 鼠 的 肝 功 能 相 关 血 清 生 化 指 标 ( AST、 ALT、 ALP、T-BIL、A / G 等)出现显著变化,且体质量出现明显下降。 肝脏指数出现明显下降,组织中羟脯氨酸含量均显著升高(P<0. 01) ,组织病理学结果显示 DEN 诱导组小鼠肝组织开始出现轻微胶原沉积。 Western blot 结果表明模型组小鼠肝组织中TGF-β1 和 α-SMA 表达显著上调,TLR4、MyD88、TRAF6 及细胞核 NF-κB p65 蛋白表达水平显著升高,细胞质 p65 NF-κB 表达显著下调。 结论 研究结果表明,肝纤维化的发生机制与肝损伤后激活 TLR4 / MyD88 / NF-κB 信号通路相关,而 TLR4 炎症通路的激活又进一步促进分泌 TGF-β1 并激活肝星状细胞从而导致大量细胞外基质沉积。 本研究表明,通过 DEN 诱导的小鼠肝纤维化发病机制可能与炎症相关,且可通过结合多个血清生化指标初步判断肝纤维化阶段。     

耳穴贴压对睡眠剥夺大鼠脾脏TLR4信号通路关键基因mRNA表达的影响

目的:通过观察耳穴贴压对PCPA(对氯苯丙氨酸)致睡眠剥夺大鼠toll受体4信号通路中TLR4(Toll样受体4)、My D88(髓样分化蛋白88)、IRAK1(IL-1R受体相关激酶1)、TRAF6(肿瘤坏死因子受体活化因子6)、NF-κB(核因子-κB)、TRIF(诱导干扰素β的TIR基域接头分子)等关键基因mRNA表达的影响,来探讨耳穴贴压治疗失眠症的作用机理及其与机体免疫功能的关系.方法:将大鼠随机分为4组:对照组、模型组、安定组、耳贴组.腹腔注射PCPA以建立睡眠剥夺大鼠模型,以磁珠贴压双侧耳穴进行干预5 d,采用实时荧光定量PCR技术检测toll受体4信号通路关键基因mRNA表达量的变化.结果:模型组大鼠经睡眠剥夺后TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB与TRIF等关键基因mRNA表达均较对照组升高约1倍,经耳穴贴压和安定干预后其表达都明显下降至对照组水平,差异均具有显著性(P0.05).结论:大鼠经睡眠剥夺后TLR4信号通路关键基因表达均升高,经耳穴贴压和安定干预后基本恢复至正常水平,说明失眠对机体的免疫功能有明显影响,耳穴贴压治疗失眠症可能与调节了机体的免疫功能有关.     

TLR2和TLR6在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用

【目的】建立鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体6(TLR6)在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用,为阐明鸟分枝杆菌致病机制提供依据。【方法】用鸟分枝杆菌感染U937细胞,于感染0h、8h、16h、24h和48h后分别提取细胞总蛋白,并通过Western blot方法检测TLR2和TLR6的表达;分别提取细胞培养上清液,利用ELISA技术检测肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化情况。用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,通过Western blot方法分别检测其促凋亡因子BAX和抗凋亡因子BCL-2的表达量,用ELISA技术检测细胞培养上清液中TNF-α含量变化情况,用流式细胞仪检测U937细胞的凋亡变化。【结果】鸟分枝杆菌感染U937细胞可引起TLR2、TLR6和TNF-α表达上调;用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,可使U937细胞内促凋亡因子BAX和TNF-α表达量下降(P0.05),抗凋亡因子BCL-2表达量升高(P0.05),并可以明显降低感染鸟分枝杆菌后的细胞的凋亡率(P0.05)。【结论】TLR2和TLR6与巨噬细胞凋亡相关,巨噬细胞通过TLR2和TLR6来识别鸟分枝杆菌,而鸟分枝杆菌反过来通过促进TLR2和TLR6的表达来影响巨噬细胞相关凋亡通路,从而诱导巨噬细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)在TNF信号传导中的作用

肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)是经TNF受体超家族和IL-1R/TLR超家族信号传导通路的重要成分.TNF信号传导中,TRAF2作为接头蛋白和调控因子在几乎所有分支通路中起作用,在调节TNF-R1介导的NF-κB和JNK激活过程中起重要作用.近来的研究提示,TRAF2是凋亡信号传导和抗凋亡信号传导的分支点.本文主要阐述TRAF2的分子结构及它的结构与功能的关系,TNF信号传导的分子机制及TRAF2在其中的作用,重点关注TRAF2作为凋亡途径和NF-κB介导的存活途径,即这2条相互拮抗的信号传导途径的分支点的重要性.     

结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体的构建及表达

为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。     

LR2和TLR6在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用

[目的]建立鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体6(TLR6)在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用,为阐明鸟分枝杆菌致病机制提供依据。[方法]用鸟分枝杆菌感染U937细胞,于感染0 h、8 h、16 h、24 h和48 h后分别提取细胞总蛋白,并通过Western blot方法检测TLR2和TLR6的表达;分别提取细胞培养上清液,利用ELISA技术检测肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化情况。用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,通过Western blot方法分别检测其促凋亡因子BAX和抗凋亡因子BCL-2的表达量,用ELISA技术检测细胞培养上清液中TNF-α含量变化情况,用流式细胞仪检测U937细胞的凋亡变化。[结果]鸟分枝杆菌感染U937细胞可引起TLR2、TLR6和TNF-α表达上调;用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,可使U937细胞内促凋亡因子BAX和TNF-α表达量下降(P<0.05),抗凋亡因子BCL-2表达量升高(P<0.05),并可以明显降低感染鸟分枝杆菌后的细胞的凋亡率(P<0.05)。[结论]TLR2和TLR6与巨噬细胞凋亡相关,巨噬细胞通过TLR2和TLR6来识别鸟分枝杆菌,而鸟分枝杆菌反过来通过促进TLR2和TLR6的表达来影响巨噬细胞相关凋亡通路,从而诱导巨噬细胞凋亡。     

结核分枝杆菌对感染小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体和铁蛋白表达的影响

探讨不同毒力结核分枝杆菌感染对小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体(TfR)和铁蛋白(Fn)表达的影响及其时相性变化。利用制备的卡介苗(以下简称BCG)和结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株(以下简称H37Rv株)悬液,分别经小鼠尾静脉注射,建立各组小鼠感染模型,各组小鼠感染模型建立成功后,分别于第1、3、5、7、9、11、13、15天,进行各组小鼠肺泡灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取各组小鼠肺泡巨噬细胞。应用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR和Fn的表达。利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达结果显示:H37RV组与BCG组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达均高于空白对照组,在感染第7、9、11天差异最明显,具有统计学意义(P0.05)。利用Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RN组、BCG组、空白对照组三组之间差异有统计学意义(P0.05)。用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RV组与BCG组的小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达量明显减低,并且于第7天时表达量最第,异有统计学意义(P0.05)。结核分枝杆菌感染小鼠,导致小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达增高,而Fn的表达降低。不同毒力的结核杆菌感染后Fn蛋白表达差异并不明显,而不同毒力的结核杆菌感染后TfR蛋白的表达有差异性。     

利用miR-17的腺病毒载体抑制肺癌细胞系增殖

miR-17是肺癌的新型调节因子,有可能在肺癌发生和进展中发挥作用,但其功能尚不完全清楚。构建miR-17的腺病毒表达载体,检测miR-17对A549细胞体外增殖、锚定非依赖性生长、侵袭和转移的调控作用。利用miR-17的腺病毒载体(Ad-miR-17)在A549细胞中过表达miR-17后,使用MTT实验检测miR-17对NSCLC细胞系A549增殖作用的影响;软琼脂成集落实验检测miR-17对A549细胞锚定非依赖性生长的作用,使用Trans-well实验检测A549细胞的体外侵袭/转移作用(in vitro invasion/in vitro migration);在此基础上共转染miR-17的inhibitor确定miR-17作用的特异性。结果表明,miR-17能够显著下调A549细胞的增殖、锚定非依赖性生长、体外侵袭/转移作用;共转染miR-17的inhibitor能够阻断miR-17的作用。     

NF-κB信号通路调控绵羊肺炎支原体感染宿主肺泡上皮细胞的作用机理

分析转录因子细胞核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路在绵羊肺炎支原体感染肺泡上皮细胞中的分子机制.用不同浓度的抑制剂BAY11-7082与细胞孵育,用Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT)法检测细胞活性,以及用实时定量PCR检测NF-κBp65和白细胞介素-8(IL-8)mRNA的表达水平,用试剂盒检测caspase-3的活性和H2O2浓度变化,接着用细菌计数检测支原体对细胞的致病力变化.结果显示,当NF-κB抑制剂BAY11-7082浓度为1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L不影响细胞活性;在24h,绵羊肺炎支原体可以显著提高NF-κBp65和IL-8 mRNA的表达水平,显著增加caspase-3的活性和H2O2分泌水平,而BAY11-7082能够显著降低IL-8mRNA的表达和caspase-3活性、胞内肺炎支原体数量;结果表明NF-κB信号通路在绵羊肺炎支原体致病机制中发挥重要作用.     

Preliminary study of the effects roles of miR-520h on glioma genesis

目的:综合分析胶质瘤标本中基因的表达,体外生物学作用的检测及对临床病例预后的长期随访,评价胶质瘤中miR-520h的生物学作用及其与NF-κB通路的关系.方法:选取46例Ⅱ到Ⅳ级胶质瘤标本,常规RTPCR检测前体microRNA(pri-miR-520h)的表达,免疫组织化学方法评估Ki-67指数;对46例患者的预后进行KPS评分及肿瘤复发与相关死亡率监测;用520h抑制剂转染U251胶质瘤细胞后缺氧培养,Western blotting检测p-NF-κB/p65等蛋白的表达水平.结果:miR-520h的RT-PCR分析及免疫组织化学结果显示,表达前体miR-520h(Pri(+))的病例Ki-67阳性率较低,而表达成熟miR-520h的病例Ki-67阳性率增加;长期随访结果显示,Pri(+)病例的KPS评分比Pri(-)病例显著增高;此外,高表达前体miR-520h (Pri(+))的病例预后较好,肿瘤复发和相关死亡率较低,说明pri-miR-520h(+)病例预后较好;Western blotting显示浓度为200 nmol/L的has-miR-520h抑制剂在缺氧条件下,促进U251胶质瘤细胞中p-NF-κB/p65的表达.结论:miR-520h在胶质瘤的发生中具有重要的作用,成熟miR-520h作为原癌miR,能诱导胶质瘤细胞的发生.     

萝卜硫素减轻子宫内膜异位症大鼠模型的慢性机械性疼痛

目的 基于HMGB1/TLR4/MyD88信号通路探讨萝卜硫素对子宫内膜异位症(EMs)大鼠慢性机械性疼痛的减轻作用。方法 通过大鼠自体子宫内膜组织移植构建EMs模型。将大鼠分为假手术组(Sham组)、EMs组、萝卜硫素低剂量组(5 mg/kg)、萝卜硫素高剂量组(15 mg/kg)、HMGB1抑制剂组(EP组)和TLR4抑制剂组(TAK-242组)。通过电子测痛仪检测大鼠痛阈情况;通过ELISA法检测大鼠血清中HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平;Western blot检测异位子宫内膜组织HMGB1、TLR4、MyD88和TRPV1蛋白水平。结果 与Sham组相比,EMs组大鼠机械痛阈值(PWT)降低(P<0.05);血清中HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平升高(P<0.05);异位子宫内膜组织中HMGB1、TLR4、MyD88和TRPV1蛋白表达升高(P<0.05)。与EMs组相比,低、高剂量萝卜硫素及HMGB1抑制剂和TLR4抑制剂均能够升高大鼠PWT,降低血清中HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平;减少异位子宫内膜组织中...     

燕麦蒽酰胺的制备及其促肺癌细胞凋亡机制研究

燕麦蒽酰胺(avenanthramides,Avns)作为燕麦中特有的活性成分,具有广泛的生理功能,但其天然含量较低。为提升燕麦籽粒中Avns天然含量、优化提取条件并分析其健康功效,采用发芽方式促进燕麦籽粒中Avns的生物转化,通过单因素实验分析不同条件对Avns提取量的影响,利用响应面试验优化提取工艺,并探究Avns促肺癌细胞凋亡的分子机制。燕麦米经发芽后,采用超声辅助传统有机溶剂浸提法对Avns进行提取;采用高效液相色谱对提取的Avns进行定性和定量分析;以标准品Avn C为对照,采用蛋白印迹法分析核转录因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)相关通路蛋白和X连锁凋亡抑制蛋白(X-link inhibitor of apoptosis, XIAP)表达情况,利用流式细胞术检测Avns对非小细胞肺癌H1299和A549细胞凋亡的影响。实验结果表明:Avns最优提取条件为料液比(g/mL)1∶22.2,超声功率87.6W,乙醇体积分数84.2%,该条件下Avns的提取量为849.251μg/g;蛋白印迹和流式细胞术实验结果显示,Avn C和Avns均可下调NF-κB/p65蛋白磷酸化及抗凋亡蛋白XIAP表达,且剂量依赖性地促进H1299和A549细胞凋亡。研究结果表明,天然Avns可能通过抑制NF-κB/XIAP信号通路活性进而促进肺癌细胞凋亡,本研究有望为全谷物燕麦特有活性成分Avns应用于肺癌防控提供理论依据。     

MDV感染B19、B21单倍型SPF鸡免疫器官中miR-146b-5p的变化规律

目的分析miR-146b-5p在B19(MD易感)与B21(MD抗性)单倍型鸡感染MDV后的表达变化规律,并探讨其可能与MD抗性/易感性相关的分子机制。方法我们在MDV超强毒株Md5攻毒实验和前期高通量测序分析发现,miR-146b-5p表达量有明显差异,为此进一步利用实时荧光定量PCR技术,检测MD感染B19和B21单倍型鸡5dpi、10dpi和21dpi,miR-146b-5p在法氏囊、胸腺和脾脏组织中的表达量变化情况。结果 miR-146b-5p在5dpi、10dpi和21dpi实验组和对照组的表达量明显不同,miR-146b-5p在B21实验组中的表达量要远高于对照组,且差异显著;而miR-146b-5p在B19实验组中的表达量高于对照组但差异不显著。结论 MD感染后,在不同免疫器官中miR-146b-5p的表达量可能存在组织特异性,不同鸡系之间在感染后也存在一定的差异,但具体机制尚需进一步深入研究。     

结核分枝杆菌标准株mazEF6缺失株的构建

为构建结核分枝杆菌标准株H37Rv毒素-抗毒素系统maz EF6基因缺失突变株。采用聚合酶链反应(PCR)技术,分别从H37Rv和PUC-19K质粒上扩增出maz EF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;应用融合PCR技术将maz EF6基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,并将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF6-kan,将构建的自杀质粒转化至大肠杆菌DH5a中;利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中;并将该菌株涂于卡那霉素抗性改良罗氏培养基,培养3-4周后,刮取能在卡那霉素抗性培养基中生长的结核分枝杆菌单个菌落,以提取的阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段,并测序。对所获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变,成功获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株。由此可知,本研究为今后研究毒素-抗毒素系统maz EF6基因的生物学功能奠定基础。     

TRAF6表达与乳腺癌侵袭能力的关系

目的:探讨TRAF6在不同侵袭能力的乳腺癌组织及细胞系中的表达.方法:(1)应用免疫组化方法检测TRAF6在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达.(2)应用Western blotting方法检测TRAF6在高、低侵袭能力癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7及正常乳腺细胞系MCF-10A中的表达.结果:(1)正常乳腺组织中TRAF6的阳性表达率低于乳腺癌组织(P0.05),在导管原位癌的阳性表达率显著低于浸润性导管癌中(P0.01).(2)TRAF6蛋白在MCF-10A中的表达低于乳腺癌细胞系中的表达,MCF-7中的表达量低于MDA-MB-231中的表达量.结论:TRAF6蛋白表达量随着乳腺癌的侵袭能力的增加而增加,说明TRAF6可能与乳腺癌侵袭能力有关.     

Physagulin H通过阻断NF-κB和JNK/MAPKs信号通路抑制LPS诱导RAW 264.7细胞产生的炎症反应

采用脂多糖诱导的RAW 264. 7巨噬细胞体外炎症模型评价physagulin H的抗炎活性.以MTT法评价细胞毒性,Griess法检测NO的含量,ELISA法检测PGE2和TNF-α水平,Western Blot法检测炎症蛋白表达(iNOS和COX-2)以及对NF-κB炎性信号通路(IκB-α蛋白降解)和对MAPKs通路(JNK,p38和ERK蛋白磷酸化)的调控作用,研究physagulin H的抗炎活性及作用机制.结果表明,physagulin H可显著降低巨噬细胞RAW264. 7中NO、PGE_2和TNF-α的释放,还可显著降低iNOS和COX-2蛋白的高表达且呈浓度依赖性.Physagulin H对LPS诱导NF-κB/IκB-α降解具有显著抑制作用.进一步的抗炎机制研究表明,physagulin H能抑制JNK磷酸化,但对ERK 1/2和p38磷酸化无明显抑制作用.综上,physagulin H是通过调控NF-κB和JNK/MAPKs信号转导通路下调LPS诱导的炎性蛋白的高表达,进而抑制小鼠巨噬细胞产生和释放过量炎症介质以及炎症因子,从而发挥抗炎作用.