衣藻肌动蛋白-绿色荧光蛋白的融合基因在烟草悬浮细胞中的表达及融合蛋白的体外聚合

将衣灌（Chlamydomonas reinhardtii)肌动蛋白（actin）基因(cDNA)与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP)基因融合后，分别构建到原核和植物表达载体中，并在BL21plus细菌和烟草悬浮细胞（BY-2）中进行表达。通过荧光显微镜观测到重组后的融合蛋白在菌体和烟草悬浮细胞中得到正确表达。肌动蛋白-绿色荧光蛋白 的融合蛋白主要分布在烟草悬浮细胞细胞膜周围，参与膜骨架的组成，另外还大量分布于细胞核周围和细胞板的位置，同时也在细胞内形成丝状结构，参与F-actin的组成。将肌动蛋白-绿色荧光蛋白融合基因的原核表达产物经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和疏水柱层析后，得以纯化，并在纯化产物中加入肌动蛋白聚合缓冲液，纯化的肌动蛋白能聚合成为丝状结构即F-actin，这表明低等藻类的肌动蛋白具有同高等植物和动物相似的性质和功能。     

NF-L和NF-M在上皮细胞内表达并与角蛋白或波形纤维蛋白共组装

神经丝及细胞质角蛋白纤维都是异源多聚体，它们只有在与其他合适的中间丝蛋白亚基一起表达时才能装配成中间丝。为了研究不同类型的中间丝蛋白间的组装特性，构建了绿色荧光蛋白（GFP）与NF－L或NF－M融合蛋白的重组腺病毒表达载体，并将目的基因在vero细胞内表达，免疫荧光观察结果显示NF－L－GFP或GFP－NF－M不但能与细胞内源性波形纤维蛋白共组装，而且同样能掺入到角蛋白纤维网络中。     

水疱性口炎病毒L蛋白N端存在新的定位信号

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) L蛋白是该病毒复制酶的主要成分, 分子量约为241 kD. 通过构建L蛋白缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的方式, 将融合蛋白置于T7启动子或CMV启动子下游, 在多种动物细胞中瞬时表达了重组的融合蛋白. 荧光显微镜观察结果显示, 仅保留N端96个氨基酸残基或缺失N端120个以上残基时, 融合蛋白均匀分布于整个细胞质中, 而含有N端120个以上残基时, 融合蛋白呈点状或局部分布于核周围部位. 截取L蛋白96～120氨基酸片段, 连接到GFP蛋白氨基端, 同样融合蛋白亦特异性地分布到核周围局部区域. 进一步研究含定位信号的25个残基片段发现, 仅13个残基的肽段QGYSFLHEVDKEA(108 ~ 120)就具有定位功能, 缺失D或V均导致定位信号完全丧失. 含有这13个残基的GFP融合蛋白, 在多种细胞和不同表达模式下均显示了同样的分布规律, 表明L蛋白N端这种定位信号具有独立的定位功能, 并且在不同细胞中是保守的.     

拟南芥根特异表达转录因子AtMYB305的鉴定及功能研究

AtMYB305是拟南芥MYB基因家族的成员之一，对其蛋白结构和DNA结合活性进行了分析鉴定，并对其表达特征和细胞内功能作了初步分析。AtMYB305含R2和R3的两个重复序列及MYB蛋白特有的其他氨基酸组成，凝胶阻滞实验证明，GST－AtMYB305融合蛋白能与含有MYB识别位点（TAACTG）的DNA片段发生特异结合。在裂殖酵母中过量表达AtMYB305蛋白产生单核长细胞，其染色体异常凝缩，半定量RT－PCR分析表明AtMYB305基因在拟南芥的根器官中特异表达。     

肾癌特异相关新基因GYLZ-RCC18的克隆及功能研究

在前期应用抑制性消减杂交技术（SSH）克隆肾癌相关新基因片段GYLZ－RCC18的基础上，应用SMART RACE技术克隆GYLZ－RCC18的全长约3．5kb(GenBank登录号：BE 825133）；应用免疫荧光原位杂交技术进行染色体定位；应用逆转录PCR的方法特异扩增其第1可读框区504 bp（碱基对）长序列片段，检测其在肾癌组织和细胞系中的表达特点，以及与肾癌组织分级、分期的关系。结果表明GYLZ－RCC18定位于第14号染色体末端，它在肾癌特异高表达，正常肾表达量极低甚至不表达，两者表达量差别在1－9倍之间；GYLZ－RCC18在高分级、高分期肾癌中表达明显高于低分级、低分期肾癌的表达。通过转染GYLZ－RCC18的反义寡核苷酸阻断其表达，可明显抑制GRC－1的生长、降低其增殖活性、减少核分裂、并诱导其持续性凋亡。研究表明GYLZ－RCC18是与肾癌发生发展密切相关的重要癌基因，它的表达与肾癌细胞的生存、增殖、抗凋亡发展密切相关，它的成功克隆为阐明肾癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径。     

小鼠BRI3基因的克隆及其诱导细胞死亡的作用

为了阐明TNFα作用的分子机制，用抑制消减杂交（SSH）技术和反转录PCR（RT-PCR),从hTNFα处理过的小鼠脑血管内皮细胞（bEnd．3）总RNA中扩增并克隆BRI3的cDNA，构建了BRI3基因与绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合的表达载体pEGFP/I3，转染L929细胞后，发现EGFP／I3融合蛋白位于细胞质里，通过TUNEL法检测或流式细胞仪分析初步表明，该融合蛋白在L929细胞中的表达能够导致细胞死亡，而且这种细胞死亡能被L929细胞中表达的Bcl－2蛋白所抑制，提示BRI3基因的功能可能与TNFα的细胞毒作用有一定的相关性。     

体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚

pEGFP－N1质粒分别转染5只绵羊卵巢原代颗粒细胞，G418筛选后，各取1株阳性转基因细胞作供体，进行绵羊的体细胞核移植（克隆），共352枚体外成熟的去核卵母细胞与转基因的颗粒细胞进行电融合，得到的329枚核移植胚胎（93．5％），用Ionomycin／6－DMAP激活，SOFaaBSA液滴体外培养7d，结果显示，312枚核移植胚胎发生卵裂（94．8％），其中63枚发育至囊胚阶段（19．1％），随机抽检发现，克隆胚胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因，4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280），胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因，4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280），与另外1株未饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率（16．3％，8／49）没有显著差异（P＞0．05），结果表明，体细胞基因转移和克隆技术的结合，可以有效地生产绵羊的转基因囊胚。     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体α 基因的调控

为研究白细胞介素2受体α亚基（IL－2Rα）基因中与负调控元件NRE（－391／－381bp）呈反向重复的序列NIRS（－153／－143bp）在该基因表达中的作用，通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性，发现NIRS与NRE不仅共同阻遏IL－2Rα基因的组成性表达，还共同参与介导RHA对该基因启动子的诱导活性。EMSA检测显示，激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白；HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白；但是，激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象，其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带，紫外交联实验检测发现，在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83。结果显示，不同细胞中，反式作用因子能通过NRE和／或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL－2Rα基因启动子活性起关键调控作用。     

反义CENP-B对HeLa (Tet-off)细胞增殖状况的影响

为了检测反义转染引起的细胞着丝粒蛋白CENP－B表达的变化情况，用原核表达的融合蛋白GST－CENP－B免疫Balb/c小鼠，制得抗CENP－B的鼠抗血清（MaCenpB）。转染了含有反义CENP－B表达载体pBI-EGFP-as-CenpB的HeLa-Tet-off细胞（HaCb），用Northern blot和Western blot研究了转染后细胞内源CENP－B基因表达的抑制情况，生长曲线表明，反义CENP－B抑制HeLa(Tet-off）细胞增殖，使倍增时间延长了32.8h流式细胞光度术分析表明，较之HeLa（Tet-off）细胞，HaCb的G1期比例增加（△G＝9％），S期比例减少（△S＝11％）。同时，有丝分裂指数（MI）大大降低；间接免疫荧光分析表明，HaCb的着丝粒组装受到抑制。这说明，CENP－B的正常表达对于细胞的增殖是必要的。     

JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞分化和凋亡的可能机制

JWA基因是受维甲酸（RA）、13顺－维甲酸（13－cRA）和佛波酯（TPA）等调控的细胞骨架相关基因，以前的研究发现，JWA基因与细胞分化和凋亡有关，为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病（APL0细胞分化和凋亡过程中的作用及机制，分别用ATRA，4HPR，TPA和As2O3处理NB4细胞，Westernblot和RT0RCR检测JWA基因在蛋白和mRAN水平的表达，同时检测细胞周期和CD11b，CD33细胞表面抗原，分析细胞分化和凋亡，结果ATRA和As2O3分别诱导细胞分化和凋亡，而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用，在诱导细胞分化和凋亡过程中，JWA基因的表达水平均上调，但PML／RARα融合基因变化不明显，用JWA反应核酸处理NB4细胞后，TPA诱导其分化和凋亡的作用受到明显抑制，TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的，在对APL（M3）原代细胞的研究中除观察到NB4细胞相似的JWA的变化外，还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白；异常分子量的JWA蛋白是否是APL（M3）区别于NB4细胞的一种分子植物志以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实。     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

大豆中NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定

植物抗病原克隆研究对于植物抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。根据预测结构域可将已知植物抗病基因分为4类，其中以NBS（nucleotide binding site)结构域为主。NBS结构域包括P环（激酶1a)、激酶2a和激酶3a。这为利用同源技术克隆植物抗病基因提供了可能。根据烟草抗花叶病毒N基因和拟南芥抗丁香假单孢杆菌RPS2基因设计兼并引物，从大豆抗花叶病毒品种科丰1号的基因组中扩增获得358个克隆，鉴定出4个能读的且与抗病基因NBS结构域同源的片段：KNBS1，KNBS2，KNBS3和KNBS4.Southern杂交表明NBS类抗病基因在大豆中为多拷贝家族；RFLP分析将KNBS4定位于F连锁群，而NBS2则与大豆抗花叶病毒基因Rsa的SCAR标记同位于J连锁群。Northern分析表明KNBS2类在大豆的根、茎和叶中为低丰度组成型表达，这为最终克隆大豆抗病基因打下了基础。     

信号转导与细胞癌变

细胞内存在两类调节细胞生长的基因-生长促进基因（即原癌基因或细胞癌基因）和生长抑制基因（抗癌基因和诱导终端分化基因），这些基因编码生长因子（或其受体）、蛋白激酶、某些酶类、鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）、转录调节因子以及其他在信号转导中起重要作用的蛋白组分，这些基因的突变或表达异常导致其编码蛋白（癌蛋白、抗癌蛋白）数量或功能异常，引起细胞生长调控紊乱，无限生长、增殖，最终导致细胞癌变，因此，研究认号转导机制对于阐明细胞癌变的化学本质具有重要意义。     

环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)参与人hsp90β基因的热诱导表达

为研究cAMP应答元件（CRE）在人热休克蛋白hsp90β基因表达中的作用，构建了数个受hsp90β基因不同长度调控片段介导的氯毒素乙酰基转移酶（CAT）报告基因质粒。分别转染Jurkat细胞并检测42℃1h热诱导前后CAT活性。结果发现删除hsp90β基因上游含CRE片段（－173／－91bp)后，CAT的热诱导表达活性降低了67％。电泳迁移率变更分析（EMSA）显示热休克后Jurkat细胞的核抽提物中磷酸化的CREB与该片段呈特异性结合。Western印迹实验及PKA活性检测发现CREB的磷酸化程度及PKA活性均随热诱导时间的延长而增加。以上结果表明：磷酸化的CREB通过与hsp90β基因上游的CRE结合参与该基因的热诱导表达，并可能与PKA传导途径有关。     

抑制COM与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸－3－O－甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A－3－O－甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶，构建了它们的单价与双价反义表达载体，并用农杆菌介导转化烟草。PCR－Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中；Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达。对表达单个及两个甲基化反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明，反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降，但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT，并且两个基因同时被抑制时，降低幅度更大，说明它们具有协同效应，组织化学染色结果表明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少。上述结果表明，抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径。     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

麻疹病毒绒猴细胞受体基因的克隆及功能鉴定

血凝素基因（ha)突变的麻疹病毒株失去了感染其敏感宿主Vero细胞的能力，但可以感染绒猴－B类淋巴母细胞系B95a，推测在B95a细胞上有这类麻疹病毒毒株的新的受体分子，为此，采用酵母双杂交系统，从B95a细胞cDNA文库中筛选，克隆了一个上述麻疹病毒血凝素蛋白（Ha蛋白）的相互作用蛋白基因－bip(b-lymphoblastoid interaction protein of marmoset)，该基因cDNA全长1540个碱基对，包含1101个碱基对的可读框，推测编码337个氨基酸组成的蛋白（Bip)，推导的氨基酸一级结构表明；Bip蛋白含有一个疏水跨膜区和一个疏水引导压，缺失突变体研究表明,Bip蛋白跨膜区缺失不影响Bip蛋白与Ha蛋白的相互作用，在麻疹病毒非允许细胞CHO（中国仓鼠卵巢细胞）中表达 bip基因，结果证明CHO／Bip 由非允许细胞变成了对上述麻疹病毒敏感的允许细胞，即表达有Bip蛋白的CHO细胞可以被麻疹病毒吸附，感染，证明bip是位于绒猴－B类淋巴母细胞中的麻疹病毒新的细胞受体基因。     

异三聚体G蛋白在细胞外钙调素调控rbcS基因表达中的作用

以转基因烟草悬浮培养细胞为材料，对异三聚体Ｇ蛋白在胞外钙调素（ＣａＭ）促进ｒｂｃＳ基因表达跨膜信号转导中的作用进行了研究．细菌毒素实验表明，Ｇ蛋白激活剂ＣＴＸ可以促进转基因烟草ｒｂｃＳ基因表达，而其抑制剂ＰＴＸ则抑制ｒｂｃＳ基因表达；同时证实ＣＴＸ可以恢复被ＣａＭ抗血清抑制的ｒｂｃＳ基因表达，而ＰＴＸ可以抑制外源ＣａＭ促进的ｒｂｃＳ基因表达，通过提纯包埋有ＧＴＰａｓｅ活性测定荧光底物的正向型质膜囊     

3-酮硫裂解酶基因phbA的克隆、序列分析及功能检测

用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌中合成聚－β－羟基丁酸酯（ＰＨＢ）的一个关键酶－３－酮硫裂解酶基因ｐｈｂＡ。ＤＮＡ序列分析表明,所克隆的基因与国外报道序列同源性很高,只有１个碱基的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率,构建了带有导肽基因的组成型表达载体,并转化烟草得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明,导肽可以将外源蛋白定位于质体,ｐｈｂＡ基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实,转基     

转芪合酶基因植物中三羟基反式芪的功能

应用RT－PCR方法，从葡萄组织中克隆了两个芪合酶基因的编码区（1．19kb)。在大肠杆菌中能特异表达42ku的蛋白质，其分子量与芪合酶大小一致，并用其制备了兔抗血清。利用pBin438构建了植物组成型表达载体，经农杆菌介导获得转基因烟草植株。PCR，Southern blot,Western blot和RT－PCR分析证明该基因已整合到烟草的染色体中，并正常转录和特异表达。薄层层析和HPLC的结果进一步判断表达的芪合酶在烟草中可催化其底物合成3，4′，5－三羟基反式芪（trans-resveratrol),从转基因烟草中纯化的3，4′，5－三羟基反式芪能使人乳腺癌细胞停留在Go,G1期的细胞数增加。