带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达

采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组中的启动子活性片段F1,构建了一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,GFP基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达．     

GFP报告因子结合流式细胞术的蛋白-蛋白相互作用单细菌水平分析

在基于腺苷酸环化酶功能重构的细菌双杂交(BACTH)系统中引入lac启动子控制的gfp基因作为蛋白质相互作用的报告基因,采用实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置(HSFCM)建立了一种单细菌水平的、简单、快速、高通量的蛋白-蛋白相互作用分析方法.将分别携带有相互作用蛋白对编码基因和gfp报告基因的质粒共转化至报告菌株,利用HSFCM对单个细菌的散射光和荧光同时进行检测.结果表明蛋白-蛋白相互作用激活了gfp报告基因的表达,并存在双稳态现象:即一部分细菌的gfp报告基因被激活,细菌荧光信号强度明显高于阴性对照组,而另一部分细菌的gfp报告基因未被激活,细菌荧光信号分布与阴性对照组重叠.利用HSFCM在单细菌水平对荧光信号强度和表达GFP报告因子的细菌比例进行分析,能有效地区分表达GFP报告因子的阳性菌和报告基因未被激活表达的阴性菌,揭示了细菌个体蛋白的异质性表达.这将为相互作用蛋白对的检测及筛选提供一种快速的分析方法.     

绿色荧光蛋白基因转化内生解淀粉芽孢杆菌的研究

通过重叠延申法将枯草芽孢杆菌的启动子PSJ2与绿色荧光蛋白基因（gfp）的ORF连接起来,构建绿色荧光蛋白表达盒,再通过Rco R I和Pxt I双酶切将表达盒连接到pUS186载体上,转化解淀粉芽孢杆菌TB2菌株,得到可发出绿色荧光工程菌,工程菌对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用与野生菌株相当。     

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

通过电击转化法,将带有gfp标记基因的pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K88、K99中,经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段.     

携带p53和p21基因腺病毒转移载体的构建

构建携带p53和p21基因的重组腺病毒转移载体以研究p53和p21联合基因治疗效果.将p53cDNA克隆到转移载体pCMV5GFP替代gfp,得到pCMVp53,使其受到CMV启动子的调控;同时将p21基因克隆到pCMVp53,得到重组腺病毒转移载体pCMVp53/p21.得到携带p53和p21基因的重组腺病毒转移载体.     

Cpf1 和 Cas9核酸酶靶向EGFR-L858R突变的研究

表皮生长因子受体(EGFR)单核苷酸突变(2573TG,L858R)占所有EGFR突变的90%.使突变的EGFR失活对有此突变的病人非常有利.这里,应用双荧光报告分析的方法分析规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)系统中Cpf1和Cas9在靶向EGFR-L858R突变的编辑效率.在EGFR-L858R突变位点的附近,有两个Cpf1前间区序列邻近基序(PAMs)——TTTN.并且,2573TG突变形成了一个Cas9的PAM——NGG.因此本文通过构建两条AsCpf1的gRNAs(gRNA1和gRNA2)和一条SpCas9的gRNA(gRNA3)在体外通过双荧光蛋白分析系统去评估SpCas9和AsCpf1特异性靶向等位基因的能力.结果证实了AsCpf1和SpCas9都能够特异性的编辑突变的EGFR(2573TG).     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpG的鉴定及其变异分析

根据水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)hrp基因的序列设计引物,通过PCR方法从水稻白叶枯病菌JXOⅢ和PXO99A菌株中扩增得到核苷酸序列完全一致的hrpG基因.以该基因为探针与JXOⅢ/pUFR034基因组文库中含有hrpX克隆pUHRX245(36.8 kb)的4个亚克隆进行southern blot分子杂交,确定在亚克隆pB1中1.3 kb大小的片段和AE4(3.0 kb)片段中存在hrpG同源序列.测序结果表明,在pB1中有586个碱基序列,在AE4中有206个碱基,共同构成完整的hrpG基因,且与已知的hrpX基因是毗邻的.以同样方法从水稻白叶枯病菌PXO99A菌株的hrp-突变体M16中扩增得到hrpG基因对应位置的同源突变序列.序列分析表明其有意义突变为541位的C→T的突变,从而导致亮氨酸变为苯丙氨酸(Leu→Phe).将hrpG基因和突变序列分别导入突变体M16中,转移结合子M16/hrpG(PXO99A)恢复了其在烟草上的过敏反应和在水稻上的致病性,而突变序列的结合子M16/hrpG(M16)则不能使其恢复功能,从而确定M16是由于单个碱基的突变所引起的功能突变.经过对基因及其产物的比对发现,对于第Ⅱ组hrp调节基因hrpG的变异,种间变化明显高于种内不同致病变种的变化.     

果蝇锌离子转运蛋白Catsup亚细胞定位分析

Catsup是果蝇体内一个功能重要的基因,其突变会导致体内多巴胺含量过高,引起果蝇致死及生殖障碍.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在确定蛋白的亚细胞定位进而在研究蛋白功能方面起着重要的作用.为了探索Catsup的亚细胞定位进而能够更好地研究Catsup的功能,文章利用基因工程技术和生物学方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增Catsup基因全长,与GFP一起连接至pUAST质粒,构建载体pUAST-Catsup-GFP,通过显微注射技术导入果蝇,获得UAS-Catsup-GFP转基因果蝇.通过克隆验证了转基因果蝇构建成功.利用该果蝇进行Catsup的亚细胞定位,确定其定位在高尔基体上,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

水稻白化突变体alb21生理特性和基因定位

高等植物叶绿体的正常发育需要叶绿体基因和核基因相互协调,这些基因的突变将导致叶绿体发育的缺陷．通过同位素诱变,获得了1例水稻的白化突变体alb21,其在幼苗时期就表现出白化性状,生长1个月左右逐渐死亡．遗传学分析表明,该突变属于单基因隐性突变;电镜观察表明,突变体细胞内完全丧失了叶绿体结构,只有一些空泡状的结构．突变体中既没有检测出叶绿素a或b,也没有检测出叶绿素合成的前体——原脱植基叶绿素a,说明此突变体的叶绿素合成途径受阻．因此,推测Alb21基因的突变,导致叶绿体发育受阻,叶绿素a或b以及叶绿素合成的前体——原脱植基叶绿素a不能合成．利用本实验室开发的水稻InDel分子标记,将该突变基因定位在第3条染色体上分子标记R3M51—2与R3M52—5之间约1520kb范围内．这些结果为该基因的克隆及叶绿体发育过程中的功能研究奠定了基础．     

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

通过电击转化法，将带有gfp标记基因的pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K88、K99中，经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光，表明gfp加基因得到稳定、高效的表达．进一步通过PCR分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明，转化菌株与原始菌株是一致的．该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段．     

一株谷氨酰胺合成酶高产菌株的酶学分析及其基因的克隆分析

对谷氨酰胺合成酶菌球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)突变菌株Y3进行分析.其谷氨酰胺合成酶摇瓶发酵单位是原始菌株的2.81倍;最适反应温度为40℃;最适pH为6.5.以突变菌株和原始菌株基因组为模板,通过同源克隆策略,成功地获得了球形节杆菌谷氨酰胺合成酶基因gln片段.通过序列比对,突变菌株gln基因在第409 bp处产生T→C的碱基的突变,该处突变使酪氨酸(Tyr409)被组氨酸(His409)取代,该突变解决了谷氨酰胺合成酶腺苷酰基化问题,保证了其在高浓度铵盐条件下保持酶活性.     

带有绿色荧光蛋白基因（gfp）的植物重组表达质料 …

利用ＤＮＡ重组技术,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）克隆到植物表达载体ｐＢＩ－１２１中,成功地构建了植物重组表达质粒ｐＢＩ－ＧＦＰ。     

秀丽隐杆线虫rict-1/daf-2&Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp双突变体构建

线虫存在与同哺乳动物同源的调控脂肪沉积及相关代谢疾病的因子和代谢通路,是一种研究脂肪沉积的模式生物。线虫中已经构建出许多脂肪沉积改变的突变体,而且目前已有利用绿色荧光指示脂肪沉积的突变体Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp,Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp在脂滴表面激发绿色荧光,因此可以直接观测线虫脂肪沉积的变化。rict-1编码线虫中与哺乳动物Rictor同源蛋白。daf-2编码线虫胰岛素受体络氨酸激酶。为了研究脂肪沉积与相关调控因子及代谢通路的关系,文章构建了rict-1/daf-2Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp双突变体。首先采用Pdhs-3∶∶dhs-3∶∶gfp的雄虫与rict-1/daf-2的雌雄同体杂交得到子一代,继而筛选出绿色荧光纯合的子三代。最后通过酶切、基因测序等方法获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体。     

牦牛GPRIN3基因的克隆及组织表达分析

为探索GPRIN3基因的生物学特性,以麦洼牦牛为试验材料,利用RT-PCR技术扩增GPRIN3基因编码区序列并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测GPRIN3在牦牛不同组织的mRNA表达水平.结果表明,克隆得到GPRIN3基因编码区序列大小为2 343 bp,编码780个氨基酸残基;麦洼牦牛与野牦牛氨基酸序列相比,一致性为99.62%,共有3个位点发生突变,分别是103(G→R)、366(T→M)、404(E→K).系统进化分析显示,牦牛与野牦牛亲缘关系最近,其次是普通牛,与黑猩猩的亲缘关系最远;含有GRIN-C超家族保守功能结构域;实时荧光定量PCR结果表明,GPRIN3在麦洼牦牛肺脏组织中表达量最高,其次是肝脏,在臀肌中表达量最低.本研究为进一步探讨牦牛GPRIN3基因及其编码蛋白的结构和功能提供理论基础,为牦牛分子育种提供新思路.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

构建eat-2/cpl-1&Plgg-1gfp∷lgg-1双突变体线虫

LGG-1是线虫中与哺乳动物LC3-Ⅰ同源的蛋白,eat-2是限制性饮食突变体,cpl-1编码组织蛋白酶L,主要表达在溶酶体中参与降解蛋白质。为了研究三者之间关系,文章构建了eat-2Plgg-1gfp∶∶lgg-1、cpl-1Plgg-1gfp∶∶lgg-1双突变体。通过Plgg-1gfp∶∶lgg-1雄虫与eat-2/cpl-1雌雄同体杂交,在F3代中,通过绿色荧光和基因测序等方法来筛选出纯合的双突变体。最后分别检测双突变体中组织蛋白酶L及咽部收缩速率的变化。     

利用比较基因组学定位马铃薯抗晚疫病主效基因R10

晚疫病是马铃薯第一大病害。马铃薯抗晚疫病基因R10抗谱广、应用价值大,常用于马铃薯抗病杂交育种。R10位点位于马铃薯11号染色体的短臂末端,与已克隆的抗晚疫病基因R3a同属于抗晚疫病主效位点的单倍型。对包含195个基因型的R10基因的分离群体进行了晚疫病菌株接种和遗传分析,确定R10为抗晚疫病菌株89148-9的主效单基因。应用比较基因组学和BSA分析,开发了6个与R10连锁的分子标记,并将R10定位在1001T和C2_At5g59960两个遗传距离为2.6cM分子标记之间。R10位于已克隆的抗晚疫病基因R3a的近端粒区。本研究所获得的遗传图谱为通过图位克隆和比较基因组学克隆R10基因打下基础。     

水稻雄性不育突变体OsMS121的遗传及定位分析

通过射线诱变粳稻9522种子获得一株水稻雄性不育突变体OsMS121．遗传分析的结果显示突变体是单基因隐性突变．细胞学观察发现突变体花粉的萌发孔在发育过程中出现异常．萌发孔的塞子体积较小，且畸形．萌发孔的孢粉素层与野生型相比较为稀疏；环状突起不明显，结构松散，呈颗粒状．用图位克隆的方法将该基因定位在水稻第二条染色体分子标记R2M16—2和R2M18—1之间约200KB范围内．这些结果为该基因的克隆及其在花粉发育中的功能研究奠定了基础。     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.