靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用

目的:设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.方法:采用生物信息学网站设计靶向c-myc基因的gRNA,以GFP作为对照设计GFP gRNA;通过T7E1筛选出编辑效率高的gRNA并将筛选的gRNA构建CRISPR/Cas9腺病毒载体并包装腺病毒,通过分析细胞增殖、周期和凋亡及迁移能力的变化来评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.结果:成功设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统能够显著抑制Hepa1-6细胞的增殖和迁移、阻滞细胞周期进程,但对细胞凋亡无影响.结论:靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统可在细胞水平明显抑制肝癌细胞的生长.     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。     

利用epiCRISPR载体表达双sgRNA实现高效的HDAC基因编辑

CRISPR/Cas9技术是广泛使用的一种基因编辑技术,它包括Cas9和gRNA 2个元件.具有内切酶活性的Cas9能够通过gRNA识别并切断目标DNA序列.细胞主要通过非同源末端连接途径修复DNA,这是一个容易产生indel的修复途径,理论上有近2/3概率产生移码突变,可以用于基因敲除.很多癌细胞系和体外培养的细胞系基因拷贝数增加了,同时敲除所有拷贝的难度增大,因此有必要开发一种高效的基因敲除方法.本实验室在前期工作中利用附着体载体表达的Cas9和gRNA,可以高效地产生indel,称为epiCRISPR系统.在本研究中,我们用epiCRISPR系统同时表达2个gRNA,可以在目标基因上删除一段DNA序列,其长度不是3的倍数,这样可以高效地产生移码突变.HDAC(histone deacetylase)基因家族编码一类负责组蛋白去乙酰化的蛋白酶,对细胞生长有重要影响,敲除难度较大.我们利用附着体载体表达双gRNA的技术成功地得到了HDAC1、HDAC2和HDAC6纯合敲除细胞系.     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

利用CRISPR/Cas9技术构建MLH1基因敲除结肠癌细胞Mc38和乳腺癌细胞4T1及其微卫星状态鉴定

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制提供细胞模型.方法:设计2条特异性靶向MLH1基因的SgRNA序列,构建lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体,经PCR、测序...     

EGFR19和21外显子突变的NSCLC的临床特征及对EGFR-TKIs的效果比较

目的探讨晚期非小细胞肺癌(NSCLC)不同的表皮生长因子受体(EGFR)敏感突变类型对表皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效的相关性。方法回顾性收集新疆医科大学附属肿瘤医院2011—2016年确诊晚期NSCLC并接受EGFR-TKI治疗的病例。采用Kaplan-Meier单因素、Cox多因素分析方法,探讨晚期NSCLC患者接受EGFR-TKIs的生存情况及影响因素。结果共收集226例接受EGFR-TKI治疗的EGFR敏感的NSCLC患者,19del突变113例,21 L858R突变113例。多因素分析结果显示,EGFR突变类型是PFS的独立影响因素。经一线EGFR-TKI治疗的NSCLC患者含19del突变组的PFS优于21 L858R突变(P=0.038),经二三线EGFR-TKI治疗,19del突变组的PFS优于21 L858R突变(P=0.012)。结论经EGFR-TKI治疗的NSCLC患者含19del突变组的PFS显著优于21 L858R突变。     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

新疆石河子地区非小细胞肺癌EGFR基因突变分析

目的分析新疆石河子地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测情况及其与临床病理特征的关系。方法收集720例确诊为NSCLC患者(包括已行EGFR基因突变检测的239例)的完整病史资料,分析EGFR基因突变情况与病理特征的相关性。结果新疆石河子地区NSCLC患者EGFR突变检测率为38.1%。检出EGFR突变113例(47.3%);女性患者突变率(63.6%)高于男性(35.7%),两者之间差异有统计学意义(P=0.000);腺癌患者突变率(52.7%)明显高于非腺癌患者(12.5%),差异有统计学意义(P=0.000);19Del突变率为41.6%,21L858R突变率为37.2%;NSCLC患者中19Del突变在女性患者中较男性常见(P=0.001),L858R突变男女间差异无统计学意义(P=0.58);腺癌中男性19Del突变率(15.5%)低于女性(29.9%)(P=0.013),L858R突变男女差异无统计学意义(P=0.796)。结论新疆石河子地区NSCLC患者EGFR突变检测率偏低,有待提高;该地区EGFR突变主要见于腺癌,女性患者;突变类型主要为19Del及21L858R,其中女性患者19Del突变比男性多见。     

基于 CRISPR / Cas9 技术构建点突变小鼠概述

摘要:2013 年 CRISPR( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas( CRISPR-associated) 系统证实能够对人的细胞和其他真核细胞进行基因组编辑,现已广泛应用于生物医学领域。 本文对 CRISPR 在点突变小鼠构建中的应 用 进 行 概 述,为 单 向 导 RNA ( single guide RNA, sgRNA) 和 修 复 模 板 单 链 寡 聚 核 苷 酸 ( single-strand oligonucleotide,ssODN)的设计及体外转录、受精卵显微注射、子代鼠的鉴定等提供理论参考。     

基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展

相较传统育种,基因编辑育种能够更精准、高效地改变植物的性状,获得优良的品种.目前应用基因编辑技术于花卉育种研究的报道相对较少.该文综述了基因编辑技术,特别是规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9(CRISPR/Cas 9)在花卉中的研究进展及其局限性,同时还就花卉基因编辑育种的发展方向进行了讨论,希望为将基因编辑更好地应用于花卉育种提供参考.     

H-蛋白中Asp-68和Tyr-70定向突变对甘氨酸裂解酶系整体酶活的调控

还原甘氨酸途径被认为是最有前景的C1（one carbon）合成途径,其核心酶系是甘氨酸裂解酶系。在前期研究中,我们在甘氨酸裂解酶系H-蛋白“解开自保护”过程的研究中初步锁定了H-蛋白空腔内的潜在关键氨基酸残基为Ser-67、Asp-68和Tyr-70,并且证明Ser-67位点对甘氨酸酶系的整体酶活有重要影响。本文对H-蛋白的Asp-68和Tyr-70位点进行了侧链带正电突变（H-D68K、H-D68H、H-D68R和H-Y70K、H-Y70H、H-Y70R突变体）,以及侧链非极性突变（H-D68G、H-D68V、H-D68M、H-D68L和H-Y70G、H-Y70V、H-Y70M、H-Y70L突变体）,并测定了各突变体在甘氨酸裂解方向上的酶活。结果发现,Asp-68位带正电突变倾向降低甘氨酸酶系的整体酶活,Asp-68位非极性突变、Tyr-70位带正电突变及非极性突变在总体上倾向于维持或提升整体酶活。其中,相对野生型H-蛋白,H-D68R突变体的酶活下降了90.2%,H-Y70R、H-D68G和H-Y70L突变体的酶活分别提高了75.6%、53.6%和146%。硫辛酰胺与H-蛋白空腔内的氨基酸相互作用的分析结果表明,甘氨酸裂解酶系整体酶活的变化是由于H-蛋白的68和70位残基的突变阻碍或促进硫辛酰胺的释放。     

基于CRISPR/Cas9的毛果杨PtrHBI1基因功能解析

目的 利用CRISPR/Cas9系统创制毛果杨PtrHBI1功能缺失突变体,初步解析该转录因子在木材形成过程中的功能,为利用基因工程手段培育制浆造纸优良性状的林木新品种提供新思路。方法 以毛果杨(Populus trichocarpa)为研究材料,根据激光显微切割技术捕获的野生型毛果杨不同细胞类型(形成层、木质部和韧皮部)RNA-seq数据,筛选得到1个bHLH家族转录因子PtrHBI1,利用毛果杨木质部原生质体系统对该基因进行亚细胞定位分析,采用原位杂交技术分析PtrHBI1组织特异性表达,采用CRISPR/Cas9技术创制毛果杨ptrhbi1突变体。对ptrhbi1突变体进行生长表型分析,利用石蜡切片对茎段横切面的各细胞类型进行形态分析,利用Klason酸水解法检测突变体木质素含量,使用高效液相色谱测定突变体纤维素和半纤维素含量。结果 亚细胞定位显示PtrHBI1基因定位于细胞核,原位杂交结果表明PtrHBI1主要在形成层和木质部表达。通过CRISPR/Cas9创制的毛果杨ptrhbi1突变体株高显著增加,茎节数和地径在一定时期显著大于野生型。此外,突变体的导管孔径显著增大,纤维细胞数量显著减少。导管细胞的数量和形成层细胞层数与野生型无差异。木材组分分析表明,与野生型植株相比,ptrhbi1植株的纤维素含量增加,木质素总量无显著变化,紫丁香基木质素与愈创木基木质素之质量比(S/G)显著降低。结论 PtrHBI1参与调控毛果杨的生长及次生木质部发育,可能在木材形成过程起着较为重要的调控作用。     

眼皮肤白化病患者的TYR基因突变类型初步研究

目的:对临床诊断为眼皮肤白化病(OCA)患者的TYR基因进行突变筛查,以了解我国大陆OCA患者TYR基因突变类型。方法:应用PCR技术扩增患者及其父母的TYR基因外显子、外显子-内含子交界区及启动子区,以DNA序列测定技术进行突变筛查与鉴定。结果:在8名患者的16个TYR等位基因内,查明9种突变;其中错义突变4种(R77Q、E294K、R299H和W 400L),无义突变2种(R116X和R278X),插入突变2种(929 insC和232 insGGG),剪切位点突变1种(IVS1-3 C>G)。结论:W 400L、R299H分别占本研究所检出全部OCA1突变等位基因的31.3%(5/16)和18.8%(3/16),可能为中国大陆人群中较常见的TYR基因突变类型。     

Cationic polymeric nanoformulation: Recent advances in material design for CRISPR/Cas9 gene therapy

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/clustered regularly interspaced short palindromic repeat associated proteins 9) gene editing platform is a promising therapeutic tool for genetic disorders, due to its ability to manipulate the pathogenic gene in genomic level and to easily target specific gene by manipulating single-guide RNA. However, its successful delivery remains a challenge. Up to now, great efforts have been made to explore an effective strategy for CRISPR/Cas9 delivery. But among those delivery methods, physical methods are mainly operated on cultured cells thus limited to laboratorial use; viral vectors are hindered by fetal immunogenic and carcinogenic effects thus dubious in clinical application. Therefore, cationic polymeric vectors, with the ability to interact with CRISPR/Cas9 system to form a nanoformulation as a non-viral approach, are attracting increasing attentions, due to advantages such as well protection of cargos, less limitation in payload size, low immunogenicity or carcinogenicity, potential modifications for further functions, and ease in mass production. In this review, the recent discoveries on polymeric vectors utilized in delivery of CRISPR/Cas9 system will be summarized. With emphasis on advanced features of those polymeric vectors or their nanoformulations to meet the demands of different CRISPR/Cas9 delivery forms (plasmid, mRNA or protein), the detailed illustrations on their disease treatment applications, such as cancer, diabetes or antibiotic-resistant infections, will also be reviewed.     

心血管疾病的基因治疗

基因治疗在先天遗传性以及后天获得性心血管疾病治疗中均具有广阔的发展前景. 对心血管疾病致病机理的深入认识和疾病基因组学研究的发展, 进一步促进了临床前基因治疗的研究进展. 但基因治疗过程中存在的机体细胞免疫反应、外源基因表达水平不足、在体基因转导效率低下等因素都成为基因治疗临床应用转化的瓶颈. 近年来, 基因导入载体和基因组编辑技术的发展为上述问题的改善和解决提供了新的思路. 目前成族规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas9 基因组编辑技术已经成功应用于动物模型的在体基因编辑, 达到了显著改善血脂指标的疗效. 进一步研究体内组织特异和高效的基因导入方式, 提高基因编辑的靶向效率和特异性, 并建立全面有效的安全评估实验体系, 将推动基因治疗向临床应用的转化. 针对心血管疾病基因治疗中基因导入载体的研究以及CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用展开讨论.     

高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA,为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录,与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率,计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%,使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠,其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。     

中国汉族人群MC1R基因多态与皮肤颜色等表型特征关联研究

皮肤癌是一种比较常见的肿瘤,在西方人群中研究表明,通过影响皮肤颜色等色素表型特征,黑色素生成通路中相关基因多态性(MC1R等)可增加皮肤癌发生风险.本研究首次在中国汉族人群中选择MC1R基因编码区的多态位点为研究对象,分析其与中国汉族人群的皮肤颜色、对阳光的敏感性、雀斑情况及头发颜色的关联性.在MC1R基因编码区发现7个SNP位点:c.200G>A,c.274G>A,c.359T>C,c.421G>A,c.488G>A,c.497C>G和c.942A>G.其中c.421G>A为新发现的SNP位点,c.497C>G则首次在中国汉族人群中报道.c.942A>G与皮肤颜色相关,其突变纯合基因型GG与皮肤颜色浅显著相关(P=0.044,OR=0.16,95%CI:0.03～0.95).c.359T>C杂合基因型TC与雀斑数目多显著相关(P=0.040,OR=5.76,95%CI:1.05～31.53),表明MC1R基因多态与中国汉族人群的皮肤颜色等色素表型特征具有一定相关性,为相关临床研究提供了参考.