一种适于意大利蜜蜂中肠总蛋白提取方法的建立和应用

依次采用不锈钢珠破碎结合IPG裂解液法、液氮研磨结合IPG 裂解液法、液氮研磨结合 PBS 裂解液法和不锈钢珠结合 PBS 裂解液法提取意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，Ap）中肠总蛋白，并通过 SDS-PAGE 对获得的总蛋白进行质量检测。结果显示，与其他 3 种方法相比，利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合 PBS 裂解液法能够提取并获得丰度较高的 Ap 中肠总蛋白，蛋白质种类较多，分子量大小为 18.4～116 kD，样品的电泳条带清晰可见。应用该方法还开展了 Ap 感染东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae，Nc）后中肠组织蛋白质的差异表达分析，结果显示感染 Nc的 Ap 中肠出现了蛋白质的上调表达；同时 SDS-PAGE 结果显示该方法也适用于中华蜜蜂（Apis cerana ceranaFabricius，Api）中肠总蛋白的提取。利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合 PBS 裂解液法提取 Ap 中肠总蛋白方法的建立将有助于对蜜蜂中肠蛋白进行鉴定分析，为深入研究蜜蜂中肠蛋白质组成、功能及其肠道免疫机制奠定基础。
     

优化海兔肝蛋白质组提取与分离技术

为了提高海兔肝脏蛋白质组的提取及研究效率,本文描述和比较了3种提取海兔肝脏蛋白质组的方法裂解液浸泡-超速离心,丙酮-TCA沉淀-裂解液浸泡,裂解液浸泡-丙酮-TCA-裂解液溶解.然后采用常规SDS-PAGE双向电泳对提取出的蛋白质进行检验,用Melanie 4 Trial软件分析电泳图谱,通过对蛋白质分辨率和斑点总数的比较,选出一种更适合海兔肝蛋白质的提取方法.结果表明采用丙酮-TCA沉淀-裂解液浸泡法提取海兔肝蛋白质所得的双向电泳图谱不论从蛋白质斑点分辨率还是总数上都优于其他两种方法,更适合提取分离海兔肝脏蛋白质.     

优化海兔肝蛋白质组提取与分离技术

为了提高海兔肝脏蛋白质组的提取及研究效率，本文描述和比较了3种提取海兔肝脏蛋白质组的方法：裂解液浸泡-超速离心，丙酮-TCA沉淀-裂解液浸泡，裂解液浸泡-丙酮-TCA-裂解液溶解．然后采用常规SDS-PAGE双向电泳对提取出的蛋白质进行检验，用Melanie 4 Trial软件分析电泳图谱，通过对蛋白质分辨率和斑点总数的比较，选出一种更适合海兔肝蛋白质的提取方法．结果表明采用丙酮-TCA沉淀-裂解液浸泡法提取海兔肝蛋白质所得的双向电泳图谱不论从蛋白质斑点分辨率还是总数上都优于其他两种方法，更适合提取分离海兔肝脏蛋白质．     

金乌贼视神经节蛋白质组分离方法的初步研究

选用TCA/丙酮沉淀法、缓冲液法、柱层析法、裂解液法和裂解液-超速离心法分别提取金乌贼视神经节蛋白质,其中蛋白质得率较高的方法有裂解液-超速离心法、裂解液法,其次为TCA/丙酮沉淀法.经双向凝胶电泳分离,并采用Melanie 4 Trial软件统计蛋白质斑点数目.发现pH 5~8范围的载体两性电解质适合于分离视神经节蛋白质组,其电泳图谱中多数蛋白质斑点清晰可见,显示出高分辩率、重复性好和易取样供质谱分析的优点,适合于开展视神经节蛋白质组学研究.裂解液-超速离心法是金乌贼视神经节最佳蛋白质提取方法.     

一种适于意大利蜜蜂中肠总蛋白提取方法的建立和应用

依次采用不锈钢珠破碎结合IPG裂解液法、液氮研磨结合IPG裂解液法、液氮研磨结合PBS裂解液法和不锈钢珠结合PBS裂解液法提取意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,Ap)中肠总蛋白,并通过SDS-PAGE对获得的总蛋白进行质量检测。结果显示,与其他3种方法相比,利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合PBS裂解液法能够提取并获得丰度较高的Ap中肠总蛋白,蛋白质种类较多,分子量大小为18.4~116kD,样品的电泳条带清晰可见。应用该方法还开展了Ap感染东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae,Nc)后中肠组织蛋白质的差异表达分析,结果显示感染Nc的Ap中肠出现了蛋白质的上调表达;同时SDS-PAGE结果显示该方法也适用于中华蜜蜂(Apis cerana cerana Fabricius)中肠总蛋白的提取。利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合PBS裂解液法提取Ap中肠总蛋白方法的建立将有助于对蜜蜂中肠蛋白进行鉴定分析,为深入研究蜜蜂中肠蛋白质组成、功能及其肠道免疫机制奠定基础。     

橡胶草叶片蛋白质提取方法的选择及双向电泳体系的优化

目的为了建立起橡胶草叶片组织的蛋白双向电泳体系。方法采用5种不同方法提取橡胶草叶片蛋白,并通过蛋白提取率和单向SDS-PAGE电泳的比较,筛选出改良TCA-丙酮沉淀法、酚-乙酸铵沉淀法、Tris浸提法3种方法进行2-DE电泳。结果表明选择改良TCA-丙酮法为最合适的蛋白质提取方法。为进一步优化体系,比较了不同染色方法、上样量和固相p H梯度预制胶条(IPG)的p H范围对双向电泳结果的影响,电泳结果表明使用17 cm p H 3-10的IPG胶条、上样量为1200μg、考马斯亮蓝染色法能分离得到更多的蛋白点,是橡胶草叶片双向电泳体系的最优条件。结论本研究初步建立了橡胶草叶片蛋白质双向电泳体系,为深入研究橡胶草蛋白质组学提供依据。     

富含高丰度蛋白的人参果实双向电泳图谱的建立

通过常规的TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法对人参果实蛋白的提取效果,确立了丙酮沉淀法更适合人参果实蛋白的提取.为进一步改善其2-DE分离效果,对丙酮沉淀法提取的总蛋白用Tris-饱和酚提纯,在其2-DE图谱效果有所改善的基础上,又在Tris-饱和酚中加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)对丙酮沉淀法提取的总蛋白进行再次提纯,最终得到质量较高的2-DE图谱,其高、低丰度蛋白都得到了较好的分离.     

2种棉花叶片总蛋白质纯化方法比较研究

以三氯乙酸—丙酮沉淀法粗提的棉花总蛋白为材料,比较了丙酮沉淀法、醋酸铵沉淀法纯化棉花总蛋白的效果.结果显示:与三氯乙酸—丙酮沉淀法提取的棉花总蛋白干粉加入裂解液后直接电泳相比较,经丙酮沉淀法和醋酸铵沉淀法处理后的总蛋白杂质干扰少、电泳结果蛋白条带清晰,蛋白含量较高,相比醋酸铵沉淀法丙酮沉淀法效果较好,适合于棉花蛋白质组学研究中纯化总蛋白质.     

提取与分离方法影响海兔口腔神经节蛋白质组的分离效果

选用丙酮沉淀法和直接裂解法分别提取离蓝斑背肛海兔(Notarcus leachii cirrosus Stimpson, NLCS)口腔神经节(Buccal Ganglion,BG)全蛋白质,发现采用直接裂解法所获得BG蛋白质种类多于丙酮沉淀法.在第一向等电聚焦电泳 (IEF)中,分别选用pH 为3.0～9.0, 4.0～6.0和 5.0～8.0 的载体两性电解质,发现载体两性电解质pH 范围为5.0～8.0时分离效果最好.使用Melanie 4 Trial软件统计BG蛋白质斑点数目约为290点,适于开展BG蛋白质组学研究.     

甘蓝(Brassica oleracea L.)叶片蛋白提取方法的比较

分别用直接提取法、丙酮沉淀法和丙酮三氯乙酸结合沉淀法提取甘蓝叶片蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明,丙酮沉淀法较适合甘蓝叶片蛋白质的提取.本文对影响SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的关键步骤进行了探讨,对凝胶的不同染色方法进行了比较,确立了一套适用于甘蓝叶片蛋白提取、定量、凝胶制备、电泳、染色以及脱色的方法.采用改良后的丙酮沉淀法提取的甘蓝叶片蛋白SDS-PAGE电泳结果显示,其条带清晰,数量多,分辨率高.     

家蚕微孢子虫侵染家蚕胚胎细胞与草地贪夜蛾细胞的病变比较

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是引起家蚕微粒子病的病原,是一种无线粒体的专性细胞内寄生的原虫.将N.bombycis经KOH处理后,接种于家蚕胚胎细胞(BmE细胞)和草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21).用倒置显微镜对微孢子虫在宿主细胞中感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察,比较两种细胞接种N.bombycis后所出现的形态学变化.接种后第12天起,两种细胞内均充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动.在感染晚期,Sf21中有许多孢子从细胞中逸出,留下许多空泡,细胞还保持一定的完整性,而家蚕胚胎细胞则在感染后期完全崩解.这种差异可能是Sf21作为一种非原宿主细胞,对N.bombycis的感染有一定耐受性有关.     

适于双向电泳分析的银杏叶绿体蛋白质提取方法

【目的】获得银杏叶绿体蛋白质的提取方法,在蛋白质水平探讨银杏光合作用对环境的响应机制。【方法】建立一种适合银杏叶绿体蛋白双向电泳分离的实验体系,采用Tris-平衡酚抽提法对银杏叶绿体蛋白质进行提取,并与三氯乙酸(TCA)-丙酮沉降法进行对比分析。【结果】Percoll密度梯度离心法适用于银杏叶绿体的提取,提取的叶绿体平均完整率在85%左右。单向电泳结果显示,与TCA-丙酮沉降法相比,在用Tris-平衡酚抽提法分离的叶绿体蛋白质泳道中,低分子质量蛋白质条带更多、更清晰。进一步的双向电泳结果表明,用Tris-平衡酚抽提法对银杏叶绿体蛋白质进行提取,蛋白质产量更高,图谱清晰,所分离的蛋白点更多,形态更好,条纹影响相对较小。【结论】Tris-平衡酚抽提法可有效地提取高质量的叶绿体蛋白质并进行双向电泳,可用于银杏叶绿体的蛋白质组学分析。     

家蚕微孢子（Nosema bombycis）对菜青虫（Pieris rapae）的感染与致病性研究

利用家蚕微孢子不污染蔬菜与环境,不感人、畜、甚至不会伤害虫天敌的特点,首次用其作为生物农药进行试验,并对重要蔬菜害虫菜青虫做了感染与致病性研究,结果证明微孢子能大量寄生在菜青虫体内,并得到理想的防治效果。     

从梨花迁粉蝶中所得微孢子虫的系统进化分析

从中国云南省野外采集的梨花迁粉蝶（Catopsilia pyranthe）中分离得到一株疑似微孢子虫,对该分离株的核糖体SSUrRNA（Small subunit ribosomal RNA）和α-tubulin基因进行克隆测序。通过序列分析及系统进化树构建,结果发现该分离株属于Nosema属的一种微孢子虫,命名为Nosema sp．CP。通过对SSUrRNA系统进化分析发现,Nosema sp．CP与家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）、斜纹夜蛾微孢子虫（Nosema spodopterae）的亲缘关系相对于菜粉蝶微孢子虫Nosema sp．MPr更加接近。通过对α-tubulin基因的系统进化分析,结果表明Nosema sp．CP与N．bombycis聚在一支上,进一步证实了它们的紧密关系。因此,本研究首次在粉蝶科（Pieridae）的梨花迁粉蝶中分离得到的Nosema属微孢子虫是与家蚕微孢子虫非常近源的一类微孢子虫,并暗示了粉蝶科昆虫感染的微孢子虫具有潜在多样性。     

适合杨树叶片蛋白质组学样品制备方法的比较

【目的】为了提高植物叶片中低丰度蛋白质的检测效率,建立有效的杨树叶片蛋白质组学分析的蛋白质提取方法。【方法】利用三氯乙酸-丙酮结合PEG分级提取方法和SDS-酚结合PEG分级提取方法对杨树叶片蛋白质进行提取,并采用SDS-PAGE和双向凝胶电泳(2-DE)对提取结果进行评价。【结果】SDS-PAGE实验结果显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG方法优于SDS-酚结合PEG分级方法。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级和非结合PEG分级提取蛋白质的双向电泳结果表明,PEG分级能有效地去除高丰度蛋白质Rubisco,提高低丰度蛋白质的检测。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级法检测的蛋白质比非结合PEG分级法多90个蛋白质点。【结论】以LTQ-Orbitrap XL分析三氯乙酸-丙酮结合PEG分级分离的一些蛋白质显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG分级对于2-DE和MS鉴定低丰度蛋白质是一种有效的分离方法。     

菠萝焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶的分离纯化及性质研究

应用硫酸铵分级分离、DEAE-纤维素、Sephadex G-200、磷酸纤维素柱层析分离纯化了菠萝叶片焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(PFP).凝胶过滤和非变性聚丙烯酰胺梯度电泳测定酶的分子量为132kD和140kD,SDS-聚丙烯酰胺电泳分析得到一条分子量为66kD的蛋白主带,表明该酶可能是由同种亚基组成的二聚体.此外,还对该酶的部分酶学性质进行了初步研究.     

对家蚕成品卵检疫技术的可靠性分析

成品卵检疫由于是对流通商品的质量检测，而母蛾检疫是对中间产品的质量检测，所以成品卵检疫应比母蛾检疫更具有质量保证。分析实验室试验与生产调查二方面的结果，成品卵毒率与微粒子病的遗传毒率、当代母蛾毒率及蚕茧产量间均存在明显的相关性，用成品卵毒率作为蚕种质量（这里主要指微孢子带毒率）的判定依据是可行的，也是可靠的。但是需着重强调的是，成品卵毒率的正确性与稳定性是成品卵检疫技术的关键，也是成品卵毒率可靠性的前提。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质鉴定

以赤子爱胜蚓为材料，经过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤和制备电泳分离得到四种纤溶酶组分．经PAGE鉴定四种组分为单一组分；SDS-PAGE测定其分子质量分别为27、28、23和33ku；等电点均在4．0以下；经甲苯胺蓝染色后都出现糖蛋白的阳性反应；用苯酚一硫酸法测定其中性糖含量分别为8.4％、13.5％、9．1％、6．8％；纤维平板法测得四种组分的活性存在明显差异；四种组分都具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用．pH值对四种组分纤溶活性稳定性的影响各不相同．四种组分对温度的适应范围较广．     

Purification and Partial Characterization of a Collagenolytic Enzyme Produced by Pseudomonas aeraginosa SCU Screened from Rotten Hides

Strain Pseudomonas Aeraginosa SCU isolated from rotten hides is shown to produce various gelatinolytic enzymes with molecular masses ranging from - 50 to - 200 kD. A gelatinolytic enzyme called PAC exhibiting collagenolytic activity is purified by SP sepharose fast flow, Sephadex G-200 gel filtration and native PAGE cutting method. The purified enzyme has an apparent molecular weight of about 110 kD by SDS PAGE without β-mercaptoethanol. Treatment withtβ-Me suggests that PAC is dissociated into three subunits approximately 33 kD, 25 kD and 20 kD with a ratio of 2:1:1, named sub A, sub B and sub C repectively. EDFA and EGTA display a significant inhibitory effect on the enzyme activity while PMSF, leupeptin and pepstain do not appreciably inhibit it. The first 15 amino acid residues of the major subunit (subA) are determined and the sequence is Ala-Glu-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Asn-Gln-Lys-Ile-Gly -Lys-Tyr. This sequence is identical to that of elastase of P. aeruginosa. The fragment of encoding mature sub A is cloned and its sequence is determined, which has a high homology with the gene of elastase. These results indicate that PAC is a novel collagenolytic metalloprotease composed of three kinds of subunits, of which elastase is the major one.