基因治疗载体的研究进展

基因治疗已经开始用于肿瘤、癌症及各种遗传性疾病的治疗当中,临床效果已经开始显现,且应用前景广阔。基因治疗的关键是采用适宜的载体材料将外源基因传递至受体靶细胞中,本文总结了基因治疗中常用的病毒、非病毒载体,报道如下。     

基因治疗中目的基因的导入方法

基因治疗正从实验室研究走向临床应用，它给医学界引入了一种全新的概念，基因治疗主要是利用病毒介导的基因转移。文中介绍了目前已应用和将要应用于人类基因治疗的逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体等的构建方法，优缺点和适于治疗的疾病。扼要地介绍了目的基因导入的理化方法。     

腺病毒载体在基因治疗中的应用进展

目前基因治疗中的载体主要包括病毒载体和非病毒载体,腺病毒载体具有不整合到基因组相对安全和高感染效率等特点,成为基因治疗中载体研究的热点和突破口。本文就腺病毒载体在基因治疗中的应用做一综述。     

肿瘤特异性溶瘤腺病毒载体的构建及其在肿瘤细胞中特异性的表达

为构建一种由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)调控的能够在肿瘤细胞中特异性增殖的新型肿瘤基因治疗溶瘤腺病毒载体系统,利用基因重组技术将hTERTp插入5型腺病毒E1A基因上游,构建肿瘤特异性增殖腺病毒AdSU,使其携带绿色荧光蛋白报告基因.同时构建增殖缺陷型腺病毒Ad-EGFP作为对照.通过Westem blot分析表明该特异性增殖腺病毒AdSU-EGFP在肿瘤细胞中特异性表达EIA.而通过荧光显微镜观察两者增殖实验发现,AdSU-EGFP在正常成纤维细胞株BJ及原代子宫成纤维细胞中无增殖,在肝癌细胞株MH-CC和肺癌细胞株A549中,则可见病毒增殖并裂解细胞的现象.由此可认为成功构建了肿瘤基因治疗的特异性溶瘤腺病毒载体系统AdSU,该系统能够在肿瘤细胞中特异性增殖并表达所携带的外源基因,这对肿瘤的定向基因治疗有着重要意义.     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

腺病毒载体与肿瘤基因治疗

基因导入系统是恶性肿瘤基因治疗中急需解决的问题，由于腺病毒作为载体介导外源效应基因在肿瘤细胞中的高效表达，使其应用日趋增多，用于肿瘤治疗的腺病毒可分为复制缺型和复制型。常用的效应基因包括：抑癌基因，并药转换酶基因，核酶基因和细胞因子基因等。     

动物腺病毒载体的研究进展

腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体,与其他病毒载体不同,腺病毒载体的诸多优点决定了腺病毒载体在基因治疗领域中具有广阔的应用前景．文章综述了腺病毒载体的结构、研发过程、构建及应用前景等,为进一步优化和利用腺病毒表达载体提供参考．     

GFP标记的GDNF重组腺病毒载体的构建和体内外表达

通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)共表达的腺病毒载体,讨论其在治疗脊髓和脑有关神经系统疾病的潜在应用价值,了解腺病毒载体在大鼠体内的分布及在体外分泌外源基因产物能力,并对其生物安全性作了初步考察,为GDNF重组腺病毒载体在临床和基础研究中的应用作了一定准备．     

哺乳动物细胞表达外源基因常用病毒载体的研究进展

文章概述了逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等四种常用哺乳动物细胞表达外源基因的病毒载体系统的来源、组成、特点及应用方面研究的进展.     

纳米材料在植物细胞生物学研究中的应用

纳米材料已广泛应用于药物载体、生物传感器、成像技术以及基因治疗等研究,相对于动物细胞而言,纳米材料在植物细胞生物学中的应用相对滞后,目前主要集中在量子点探针标记技术和纳米基因载体介导外源基因遗传转化两方面。据此,笔者主要介绍了近年来的量子点合成及功能化等方面的进展,特别对于在植物细胞成像中应用进行了评述。另外还介绍了纳米基因载体的种类和特征,以及在植物完整细胞或原生质体中介导外源基因遗传转化等方面的研究进展。笔者认为已有的纳米材料存在粒径过大或自身的细胞毒性过大,限制了其在植物细胞生物学中的进一步应用,所以针对植物细胞自身特征,设计合成新型的纳米材料将是未来研究的焦点。     

腺病毒-腺相关病毒嵌合载体的研发趋势

分析腺病毒-腺相关病毒(Ad/AAV)嵌合载体母体中,3代Ad载体及AAV载体所具有的优势和存在的缺点.阐述Ad/AAV嵌合载体的制备方法、生产工艺,以及其在稳定转染造血干细胞、Duchenne型肌营养不良症(DMD)的基因治疗和人内啡肽基因的表达研究等方面的最新研究进展.同时指出,Ad/AAV嵌合载体是近年发展起来的嵌合病毒载体,它融合了Ad和AAV两种常用的病毒载体的优点,理论上接近理想临床应用的载体,但还需要通过大量的,特别是动物体内的应用研究去检验其优越性,以满足临床治疗需要.     

肿瘤基因治疗载体的研究进展

对在肿瘤基因治疗中较常见的载体--病毒载体(痘苗病毒载体、腺病毒与腺病毒相关载体、单纯疱疹病毒和逆转录病毒)和非病毒载体(脂质体和稳定质粒--脂质颗粒)进行了介绍,同时对其存在的问题作了简要阐述,并对该研究前景进行了展望.     

慢病毒载体研究进展

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展。本文就慢病毒载体及应用方面的研究进展作一综述。     

心血管疾病的基因治疗

基因治疗在先天遗传性以及后天获得性心血管疾病治疗中均具有广阔的发展前景. 对心血管疾病致病机理的深入认识和疾病基因组学研究的发展, 进一步促进了临床前基因治疗的研究进展. 但基因治疗过程中存在的机体细胞免疫反应、外源基因表达水平不足、在体基因转导效率低下等因素都成为基因治疗临床应用转化的瓶颈. 近年来, 基因导入载体和基因组编辑技术的发展为上述问题的改善和解决提供了新的思路. 目前成族规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas9 基因组编辑技术已经成功应用于动物模型的在体基因编辑, 达到了显著改善血脂指标的疗效. 进一步研究体内组织特异和高效的基因导入方式, 提高基因编辑的靶向效率和特异性, 并建立全面有效的安全评估实验体系, 将推动基因治疗向临床应用的转化. 针对心血管疾病基因治疗中基因导入载体的研究以及CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用展开讨论.     

病毒载体滴度对基因转移效率的影响研究

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度，应用此两种病毒载体介导ＬａｃＸＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶细胞Ｋ５６２，探讨病毒滴度对基因转移效率的影响，实验结果表明，病毒滴度与转染效率呈正相关，逆转录病毒滴度由１０＾６ＣＦＵ／ｍＬ。     

靶向hTERT的shRNA腺病毒载体的构建及其对MCF-7细胞hTERT表达的影响

设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT,构建siRNA表达质粒PgenesilhTERT;随后将shRNA表达框克隆到入门载体pENTRTM1A,构建重组质粒pENTR/U6-hTERT-polyA;使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL-DEST,得到重组腺病毒质粒pAd/U6 –TERT-polyA;线性化的重组腺病毒质粒在HEK 293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒rAd-hTERT.同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照rAd-HK,空病毒对照rAd-blank和只含EGFP的rAd -EGFP.四种病毒经酶切、电泳分析表明插入序列正确,腺病毒载体构建成功.Western blotting测定转染后各组hTERT蛋白的表达情况,证实转染rAd-hTERT 48 h后,hTERT的表达明显被抑制.实验表明基于Gateway技术的腺病毒介导的shRNA载体构建成功,rAd-hTERT可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT基因的表达.本研究为针对端粒酶的基因治疗奠定了实验基础.     

病毒载体滴度对基因转移效率的影响研究

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度．应用此两种病毒载体介导ＬａｃＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶细胞Ｋ５６２，探讨病毒滴度对基因转移效率的影响．实验结果表明，病毒滴度与转染效率呈正相关，逆转录病毒滴度由１０６ＣＦＵ／ｍＬ降至１０４ＣＦＵ／ｍＬ时，用其转染Ｋ５６２细胞的转染效率由９０％降至２０％；ＣＡ启动子腺病毒滴度由０．４×１０９ＣＦＵ／ｍＬ降至０．２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ时，对Ｋ５６２细胞的转染率由１００％降至３５％．同时表明，腺病毒滴度高，其转染率亦远比逆转录病毒高     

用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建

克隆hCbfa1的cDNA基因,构建其重组腺病毒载体,以用于研究hCbfa1腺病毒载体在人造骨移植中的作用.将hCbfa1的cDNA目的片段插入腺病毒柯氏质粒PAxCAwt中,再将此质粒与腺病毒DNA末端蛋白复合物共转染293个细胞,通过同源重组构建hCbfa1重组腺病毒载体.重组得到的阳性克隆经酶切、测序鉴定正确,包装纯化后,检测得病毒滴度为2×109PFU/mL,从而成功地构建了hCbfa1重组腺病毒载体,为下一步应用到人造骨移植的转基因治疗打下了基础.     

肿瘤基因治疗的临床应用

基因治疗方法是通过基因转导技术赋于靶细胞一种新的功能或改变靶细胞某些基因的表达状况。目前基因治疗的疾病主要包括遗传性疾病、免疫缺陷病、肿瘤等。1991年12月在复旦大学遗传学研究所进行了国际上首例血友病的基因治疗。两位由于凝血因子Ⅸ缺乏而患有血友病B的患者被重新植入了大量转移有正常Ⅸ因子基因的自身皮肤成纤维细胞,结果病人体内Ⅸ因子含量都成倍上升,取得较好疗效。1990年9月,美国国立卫生研究院(NIH)用基因疗法治疗了一位由于体内腺苷脱氨酶(ADA)缺乏而患者严重联合性免疫缺陷的病人,他们将转移有正常ADA基因的患者自身淋巴细胞体外培养后重新大量输回病人体内,实验结果令人鼓舞。目前基因治疗已应用于很多种疾病。 肿瘤的基因治疗始于九十年代。1990年美国NIH首次对一位晚期恶性黑色素瘤病人进行了基因转导的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)     

基因治疗中病毒载体的研究进展

目的:在基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段得到了迅速发展的同时,探讨病毒载体在基因治疗中的应用。方法:通过对各种病毒载体的改造和完善,扩大其载体容量,提高基因的转染效率和克服体内的免疫反应等手段,可使病毒载体的应用更加符合临床的需要。结果:改造过的病毒载体大大提高了载体靶向的特异性和应用范围。结论:病毒以其独特的生物学特性作为基因治疗载体有着独特优势,在临床上得到了广泛应用。