IGF-Ⅱ and IGFBP-1 reversely regulate blastocyst implantation in mouse

Insulin-like growth factor (IGF)-Ⅱ and IGF binding protein (IGFBP)-1, members of IGF family, are important in the cyclic development of endometrium and the blastocyst implantation. In the present study, the indirect immunofluorescence showed that IGF-Ⅱ and IGFBP-1 were specifically expressed at the maternal-fetal interface. In a co-culture system, IGF-Ⅱ significantly enhanced the attachment and outgrowth of the blastocyst on monolayer of uterine epithelial cells, while IGFBP-1 did not affect the blastocyst attachment, but markedly inhibited the blastocyst outgrowth. The results of zymography showed that IGF-Ⅱ enhanced the activities of MMP-2 and MMP-9, while IGFBP-1 did not affect the activities of MMP-2 and MMP-9. In conclusion, the equilibrium between the invasion of trophoblast and the inhibition of deciduas may be regulated by the interaction between the IGF-Ⅱ-expressing invading cytotrophoblast and maternal deciduas-derived IGFBP-1.     

人白细胞介素7重组蛋白原核表达载体在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的:构建重组人白细胞介素7(rhIL-7)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并鉴定.方法:以RT-PCR方法扩增编码IL-7的cDNA片段,插入至pET-3d载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3),优化rhIL-7表达条件,利用免疫印迹鉴定重组蛋白.结果:重组载体经DNA测序显示包含正确的rhIL-7编码序列,重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导后外源蛋白表达,相对分子质量为17 400,与IL-7理论分子质量一致;免疫印迹显示,外源蛋白可以被人IL-7特异性抗体识别,表明在原核表达的外源蛋白是rhIL-7.rhIL-7主要表达于包涵体中,包涵体表达优化条件为:温度为37 ℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为4 h.结论:成功的构建了rhIL-7的原核表达载体.     

VMIP—Ⅱ肽在大肠杆菌中的双辅助助子高效表达

目的构建病毒趋化因子(vMIP-II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP-II重组肽. 方法用PCR法获得vMIP-II基因片断,将其插入表达载体pQE,构建重组表达载体pEh-vMIP. 表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆. 结果阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP-II重组肽,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符(约8×103)的诱导表达条带, 其表达量约占菌体总蛋白的20%. 分析表明,vMIP-II重组肽主要以可溶性形式表达. 结论用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP-II的成功,为进一步研究vMIP-II的功能及应用奠定基础,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法.     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

Ⅱ型猪圆环病毒ORP2基因的原核表达与初步应用

Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的重要病原．本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORP2为模板，扩增截短的ORP2（tORF2）基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒pGEX-tORP2并转化大肠杆菌BL21（DE3）．经SDS-PAGE及Western blot鉴定，成功表达了谷胱甘肽S转移酶（GST）融合的tORP2，重组蛋白分子量约为45ku，表达量约为菌体总蛋白的20％，重组蛋白具有良好的免疫学活性．用tORP2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）阳性猪血清进行Western blot检测，有4份（20％）血清显示PCV2抗体阳性，说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象．本研究初步证明表达的tORV2重组融合蛋白可以应用于临床检测．     

海水养殖真鲷肝CYP1A基因的克隆与表达

根据国外已发表野生真鲷（Pagrus major）肝CYP1A cDNA同源序列，利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从我国海水养殖真鲷（Pagrus major）的肝脏中扩增出P4501A基因全长cDNA序列（1548bp）．用基因重组技术将P4501A cDNA克隆于pTrc-CKS载体，在大肠杆菌TOP10F＇诱导表达，将细菌总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；其表达产物为89ku，获得了表达融合蛋白CKS-CYP1A．该项研究将为利用免疫学技术研究有机污染物的毒性效应机制以及探讨P450酶作为毒性效应的生物标志物奠定基础．     

重组人截短型IL—6表达载体的构建及表达

旨在建立人截短型IL-6原核高效表达系统。用PCR方法获得截短的人IL-6基因（rhIL-6cDNA）,将其插入克隆载体pUC18中,经证实后再克隆入表达载体pBV220中,鉴定阳性表达载体。结果建立了截短型IL-6基因的克隆载体,经测序证实完全正确;构建了截短型IL-6的原核表达质粒pBV220/rhIL-6并获得高效表达;初步纯化的表达蛋白的比活性为5×10     

IGF-Ⅱ和HBxAg及ras基因在树鼩实验性肝癌组织中的表达

用免疫组化方法观察胰岛素样生长因子Ⅱ（ＩＧＦ－Ⅱ）ＨＢｘＡｇ及ｒａｓ基因的表达蛋白Ｐ＾２１在乙肝病毒（ＨＢＶ）和黄曲霉素Ｂ１（ＡＦＢ１）致树Ｑｕ肝癌过程中的表达，发现这三种基因蛋白的表达与肝癌发生呈正相关系，即接受ＨＢＶ和ＡＦＢ１双因素的树Ｑｕ的肝癌发生率与ＩＧＦ－Ⅱ，ＨＢｘＡｇ及ｐ＾２１的表达阳性率均显著高于只暴露于单一因素ＨＢＶ或ＡＦＢ１的动物。同时，在带瘤树Ｑｕ中，这三种基因的表达又显著高于     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

鳜免疫球蛋白轻链基因在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR技术从鳜(Siniperca chuatsi)头肾总RNA中获得了免疫球蛋白轻链cDNA,克隆到pGEM-T载体上并测序.测序的2个克隆其可变区cDNA序列相同率为97.3%,属于鳜的同一个轻链可变区基因家族,其变异主要存在于互补性决定区.根据鳜与其他辐鳍鱼类轻链氨基酸序列的多重对准,鳜同鲑(Salmo salar)的可变区的相似性最高(65.7%).而在恒定区,鳜同花狼(Anarhichas minor)的相似性最高(96.3%),都存在特有的连续的丝氨酸残基;鳜同虹鳟(On-corhynchus mykiss)L1型(62.1%)和斑点叉尾(Ictalurus punctatus)G型(57.2%)轻链也有较高的相似性.将鳜轻链基因分别克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pExSec1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式得到高效表达.另外,结合鳜轻链基因序列及其表达产物的分析结果,推断鳜也有两类轻链.     

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体，PCR合成ompT引导序列，插入该载体多克隆位点上游，构建了分泌型原核表达载体pTO-OT．将2个外源基因克隆至pTO-OT，2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达．表达产量在25％～34％之间．Western blot分析证实了融合蛋白可被大肠杆菌信号肽酶有效地切割。并具有良好的免疫学活性．对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的表达稳定性，显示了其在基因工程中的应用价值．     

水稻细胞分裂氧化酶的原核表达

从水稻日本晴幼叶中提取RNA,以反转产物c DNA为模板PCR扩增得到了细胞分裂素氧化酶基因(CKO),酶切连接到p ET-28a载体上,构建了重组载体p ET-28a-CKO,在大肠杆菌BL21中表达了细胞分裂素氧化酶.     

谷子乙酰辅酶A羧化酶BC功能域的克隆及原核表达载体的构建

根据已知的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)序列设计合成了1对引物,对ACCase基因的BC功能域进行扩增,所得产物与预期片段大小一致,约1.8kb。该片段与克隆载体PGEM TEase连接,转入感受态大肠杆菌DH5а中增殖。提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆与原核表达载体PQE30分别用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后回收目的片段进行连接,并转入感受态大肠杆菌M15中,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

用离散量预测原核生物蛋白质的亚细胞位置

基于不同亚细胞位置中蛋白质的氨基酸组成及序列信息不同这一观点，以单个氨基酸含量及两两组合氨基酸含量为信息构成离散源，分别计算了原核生物蛋白质三类亚细胞位置的标准离散量D(Z)，D(Xp)，D(Xc)．利用离散增量的概念预测蛋白质的亚细胞位置，它是由这个蛋白质的离散量D(X)与三个标准离散量D(Xc)，D(Xp)，D(Xc)之间离散增量的最小值所决定的．采用Self—consistency检验和Jack—knife检验方法，给出了选择五组不同信息作为离散源中参数时的预测结果．与现有的方法比较，发现用Jack—knife检验法预测extracellular类蛋白质时，给出的离散量方法能够给出最好的预测性能，结果也表明提取更多有效的序列信息是提高预测精度的关键．     

金黄色葡萄球菌isdB基因克隆、表达及其抗原性鉴定

为了构建含牛源金黄色葡萄球菌isdB基因的原核表达载体,并确定其在大肠杆菌表达系统中的表达效果,应用PCR方法扩增出osdB基因片段与原核表达载体pQE-30,构建了重组原核表达载体pQE-30-isdB,将该重组载体转化至E.coli XL1-Blue中诱导表达蛋白.经SDS-PAGE和Westem blot鉴定,P...