多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

利用PCR-DGGE技术分析硫化镍矿浸矿体系中的细菌群落演替

 浸矿体系中的菌群结构及其演替规律与浸出率具有密切的关系,为了解硫化镍矿浸矿体系中的这种关系以提高浸出率,利用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术结合16S rRNA基因序列对体系的细菌种群结构进行分析.研究表明,在硫化镍矿浸矿体系中,菌群组成菌属为嗜酸氧化亚铁硫杆菌属(Acidithiobacillus),并在浸矿体系中具有明显的演替现象,浸矿体系中的菌株演替和浸出率具有明显的相关性,经过21d的浸出,硫化镍矿的浸出率达到70%,探索浸矿体系中细菌的种群结构及其演替与浸出率的关系,对优化浸出体系菌群组成,提高浸出率具有指导作用.     

粘质沙雷氏菌抗铜基因的克隆及性质研究

 通过构建粘质沙雷氏菌KMR-3菌株的基因组DNA文库,克隆到了与该菌的铜抗性相关的基因,并对其部分特性进行了研究.结果表明克隆到的铜抗性基因所编码的蛋白属于CutF蛋白,由194个氨基酸编码,与莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC43969抗铜脂蛋白NlpE同源性最高,达到70%,并对该基因的调控序列(启动子、终止子、SD序列及转录起始位点)进行了分析.     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

两个苹果酸酶的表达和酶学性质分析

为了探讨深黄被孢霉M6-22中不同苹果酸酶的性质,研究从深黄被孢霉M6-22中克隆得到苹果酸酶MIME1基因并在大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和NADPH,具有苹果酸酶的特性.同时与前期获得的MIME2进行酶学性质分析.结果显示,重组表达的MIME1和MIME2都具有苹果酸酶的性质,但MIME1的最适温度和最适pH分别为28℃和7.5,MIME2的最适温度和最适pH分别为30℃和5.8,而且在最适温度和最适pH条件下所纯化的MIME1和MIME2酶活分别为292.84 U/mg和235.14 U/mg.进一步酶学性质分析表明,Mg~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn ~(2+)可以提高MIME1的活性,其中Cu~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Ca~(2+)、Mn~(2+)对MIME1的活性则有抑制作用;Mn~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)和Ca~(2+)对MIME2表现出不同程度的激活作用,其中Mn~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Cu~(2+)和Zn~(2+)则对MIME2的酶活表现出明显的抑制作用.这些分析结果表明,同一种细胞中不同的苹果酸酶具有不同的酶学性质,这可能与它们执行不同的生物学功能有关.通过异源表达和分离纯化,研究初步揭示了2个深黄被孢霉M6-22苹果酸酶的一些酶学性质特点,这为以后深入研究该苹果酸酶结构和功能以及与M6-22菌株油脂积累的关系提供了理论依据和参考.     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

低温脂肪酶产生菌筛选与鉴定、产酶条件及酶学性质研究

 昆明东站一家屠宰厂冷库中筛选到14株产脂肪酶低温菌株.选取1株胞外低温脂肪酶高产菌,进行显微形态及生理生化特征、16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为Yersinia enterocolitica的一株菌,命名为KM1.对该菌发酵产酶条件研究,发现其最佳产酶发酵条件为:培养温度13℃,pH7.2,摇瓶培养时间54h.在最佳产酶发酵条件下酶活由1.8U/mL提高到3.1U/mL,提高了72%.对该菌脂肪酶的酶学性质研究表明:在0℃时仍具有最高酶活的20%,最适反应温度37℃,最适反应pH为9.0.在25℃以下,pH7.2～10范围内均能保持良好的稳定性.该酶在有机溶剂中较稳定,即使在50%的甲醇中仍能保持60%以上的活性,该酶的最适底物为C₈的酯化物,且对C₄～C₁₂的酯化物均有较好的催化能力.     

嗜热脂肪芽孢杆菌YN8674热杆菌素产生条件和过程

采用多因子正交试验方法，确定了一组ＹＮ８６７４热杆菌产生的优化组全培养基，发现培养其中的碳源和无机盐对热杆素菌ＹＮ８６７４产量影响最大，通过对热杆菌素ＹＮ８６７４产生研究，发现热杆菌素产生的最适培养温度是６０℃，最适初始ＰＨ是６．５，而菌体生长的最适培养温度是６５℃，最适初始ＰＨ是７．０热杆菌素ＹＮ８６７４是在菌体生长到对数期中期开始产生，与菌体的生长、发酵液ＰＨ的变化密切相关。     

腾冲热海嗜热噬菌体的分离及特征研究

从腾冲热海温泉中分离嗜热噬菌体,并初步分析其特征。采用双层平板法分离纯化嗜热噬菌体,对分离得到的噬菌体进行电镜形态观察和生理生化分析。结果从腾冲热海温泉中分离得到的噬菌体为长杆状;其感染宿主菌NJ2形成清晰的噬菌斑,最适感染温度为55℃,最适感染pH值为7.5。该噬菌体对氯仿不敏感;但其对非离子去垢剂SDS和对蛋白酶K敏感。将这株噬菌体命名为嗜热芽孢杆菌杆状噬菌体TBRP3(Thermophilic bacillus rod-shaped phage 3)。     

热杆菌素YN8674的初步纯化和部分理化性质

采用离心、过滤、浓缩、葡聚糖凝胶柱层析等方法对热杆菌素ＹＮ８６７４进行了初步纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初步纯化样品还有两条谱带。研究了初步纯化样品对热、４℃贮存期、ｐＨ和用五种酶处理后的剩余活性,结果表明,热杆菌素ＹＮ８６７４是一种极其稳定的抑菌物质,经１２１℃、１５磅高温高压处理３０ｍｉｎ后还残存３．１％的活力,抑菌圈仍清晰可见;４℃冰箱中贮存６０ｄ,其活性几乎不受损失;经核糖核酶、纤维素酶