SCF和IL—3对脐血造血细胞长期液体培养的影响

考察了干细胞因子（ＳＣＦ）和白介素３（ＩＬ－３）的不同浓度（５～１００ｍｇ／Ｌ）组合对不同接种密度（分别为３×１０５、６×１０５、１０×１０５ｃｅｌｓ／ｍＬ）的脐血（ＣＢ）细胞扩增和分化的影响。在５种组合下,ＣＦＵ－ＧＭ的扩增倍数都是在ＣＢ单个核细胞培养１２ｄ后达到最高（（１６．４３±２．０８）～（３７．０２±４．６９）,平均为（２５．７５±３．２６））,各组合之间相差较小;而细胞总数的扩增倍数在培养２４ｄ后达到最高（（１４．３８±２．７２）～（３５５．２６±３５．５３）倍,平均为（１０３．４５±３８．７５））,各组合之间相差很大。结果表明,在静态细胞培养过程中细胞密度较高,不利于ＣＦＵ－ＧＭ和总细胞的扩增,如保持在较低细胞密度有利于总细胞数的扩增;细胞因子的浓度对ＣＦＵ－ＧＭ的峰值影响不大,但低浓度能使总细胞数的扩增明显减少。     

脐血单个核细胞的搅拌悬浮培养

研究了悬浮培养中接种密度、换液和优化培养中所用细胞因子组合对造血细胞扩增的影响。结果表明,较高的接种密度(1.0×106cells/mL)比低接种密度(0.5×106cells/mL)更有利于总细胞、粒巨噬集落形成单位(CFU-GM)和巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk)的扩增。换液能及时补充葡萄糖和移出培养中产生的乳酸,从而不对细胞生长造成影响,而且可以成功地控制pH不超出造血细胞正常生长所需pH范围。在SCF、IL-3和IL-6组合基础上添加Flt-3配体(FL)和促血小板生成素(TPO)能比原来的SCF、IL-3和IL-6组合更能促进总细胞、CFU-GM和CFU-Mk的扩增。     

人α2a干扰素酵母工程菌高产培养条件的研究

研究了摇瓶培养条件对人α2 a干扰素酵母工程菌生长及表达的影响 ,结果表明 ,当基础料中腺嘌呤含量为 2 0 μg/m L,在发酵进行至 1 2 h时再加入 2 0 μg/m L腺嘌呤时 ,IFN- α2 a生物活性及比活分别达到 7.3× 1 0 6IU/m L及 6.77× 1 0 7IU/mg。发酵过程中后期补入适量萄萄糖 ,且维持低糖水平 ,有利表达。维持总碳源含量不变 ,使培养基中葡萄糖与蔗糖的比例为 1∶ 0 .1 ,结果 IFN-α2 a生物活性及比活分别比对照增加了一倍以上。在发酵进行至 1 2 h时 ,加入 2 g/L谷氨酸 ,IFN-α2 a生物活性及比活分别比对照提高了 1 .76倍及 1 .94倍 ,而添加 0 .2 5～ 1 .0 g/L赖氨酸也能显著提高表达水平。培养基初始 p H对产物表达有较大影响 ,初始 p H为 6.5时 ,对表达最有利。利用上述摇瓶培养优化条件 ,在 2 .6L生物反应器中进行补料分批培养 ,人 α2 a干扰素生物活性达到 1 .3×1 0 7IU/m L ,为原工艺的 3倍。     

人α2a干扰素酵母工程菌高产培养条件的研究

研究了摇瓶培养条件对人α2a干扰素酵母工程菌生长及表达的影响,结果表明,当基础料中腺嘌呤含量为20μg/mL,在发酵进行至12h时再加入20μg/mL腺嘌呤时,IFN-α2a生物活性及比活分别达到了7.3×106IU/mL及6.77×107IU/mg.发酵过程中后期补入适量葡萄糖,且维持低糖水平,有利表达.维持总碳源含量不变,使培养基中葡萄糖与蔗糖比例为1∶0.1,结果IFN-α2a生物活性及比活分别比对照增加了一倍以上.在发酵进行至12h时,加入2g/L谷氨酸,IFN-α2a生物活性及比活分别比对照提高了1.76倍及1.94倍,而添加0.25～1.0g/L赖氨酸也能显著提高表达水平.培养基初始pH对产物表达有较大影响,初始pH为6.5时,对表达最有利.利用上述摇瓶培养优化条件,在2.6L生物反应器中进行补料分批培养,人α2a干扰素生物活性达到了1.3×107IU/mL,为原工艺的3倍.     

从脐血单个核细胞定向诱导巨核细胞的生成

采用 SCF、TPO、IL- 3、IL- 6、IL- 1细胞因子 ,从脐血单个核细胞定向诱导巨核细胞的形成。比较了 SCF+ TPO+ IL- 1、SCF+ TPO+ IL- 3、SCF+ TPO+ IL- 63种细胞因子组合对刺激巨核细胞生成的作用 ,经体外培养 8d后 ,CD41 + 细胞占培养物的比例分别达到 ( 5 .64± 0 .77) %、( 5 .73± 1 .2 4 ) %和 ( 2 0 .1± 2 .5 3) % ;每 1 0 4个细胞可形成巨核祖细胞集落形成单位 ( CFU- MK)为( 1 3.7± 5 .7)个、( 1 5 .0± 3.6)个和 ( 93.7± 1 6.0 )个。在 SCF+ TPO+ IL- 6体系中增加 IL- 6的浓度 ,可提高培养液中 CD41 + 细胞的纯度。当 IL- 6的浓度从 1 0μg/L增加到 5 0μg/L时 ,CD41 + 细胞的比例可从 ( 2 0 .1± 2 .5 3) %提高到 ( 2 6.81± 3.2 0 ) % ,但每 1 0 4个细胞形成 CFU- MK数目却从( 93.7± 1 6.0 )个减少到 ( 4 5± 8.6)个 ;这说明 IL- 6对巨核细胞的刺激主要作用在其发育的后期。采用 SCF+ TPO+ IL- 3+ IL - 6细胞因子组合 ,由 1× 1 0 6个单个核细胞培养一周后可诱导出 ( 1 .61±0 .5 8)× 1 0 5个 CD41 + 细胞 ,占培养物的比例可达到 ( 1 8.8± 1 .64) % ,每 1 0 4个细胞形成 CFU- MK数目可达到 ( 1 2 1 .8± 1 0 .3)个。这一结果为进一步体外大量扩增巨核细胞提供了基础     

GM-CSF体外促进多倍体巨核细胞的生成

在TPO IL-3的细胞因子组合中添加不同浓度GM-CSF，从脐血CD34^ 细胞定向诱导巨核细胞的形成，以此考察GM-CSF对巨核细胞体外扩增和成熟的作用。比较了TPO IL-3、TPO IL-3 GM-CSF(5、20、100μg／L)的4种细胞因子组合对巨核细胞扩增及形成多倍体的作用。结果发现：在TPO IL-3的细胞因子组合中添加GM-CSF有利于总细胞的扩增，对巨核细胞的纯度没有显著的影响。体外培养14d后，培养物巨核细胞中多倍体(≥8N)巨核细胞比例明显提高，从中可以看出GM-CSF能促进巨核细胞多倍体的形成。     

从脐血单个核细胞诱导树突状细胞

探讨了从脐血单个核细胞定向诱导 DC的方法以进一步研究树突状细胞的功能与特性。从脐血中获取单个核细胞 ,在培养液中加入 GM- CSF、TNF- α、IL- 3、IL- 4,培养 1 4d后流式细胞仪分析细胞表面标志 CD1 a;培养末期加入 LPS,流式细胞仪分析细胞表面标志 CD83及 HLA- DR。发现用 GM- CSF+TNF-α+IL - 4可获得 ( 3 6 .79± 3 .1 5 ) % CD1 a+ 细胞 ,LPS可使 CD83及 HLA- DR的比例从 ( 0 .5 7± 0 .5 6 ) %及 ( 40 .2 7± 6 .3 3 ) %分别升至 ( 3 2 .79± 1 2 .90 ) %及 ( 95 .5 2± 3 .45 ) %。实验证明脐血单个核细胞作为另一种主要来源 ,经特定细胞因子诱导可生成大量 DC,并能通过 LPS刺激 DC成熟     

影响脐血造血细胞体外培养与检测的因素

考察了分离方法、血浆（血清）、渗透压、细胞因子的保存等因素对脐血造血细胞体外培养和检测的影响。结果表明，用明胶沉降加密度梯度离心分离两步法分离比传统方法能分离到更多的单个核细胞；混合脐血血浆比胎牛血清更能支持造血细胞的生长；高渗透压对集落形成有一定影响，而低渗透压对集落形成更为有害；在３７℃下保存细胞因子，其生物活性下降最快，－３０℃冷冻保藏较好地保持其活性，解冻次数对生物活性影响不显著。     

一种测定动物细胞平均沉降速率的新方法

通过构建细胞沉降过程的理想化模型，提出了一种简易的细胞沉降速率测定方法。标准颗粒沉降实验结果验证了这种方法的准确性。利用该方法测定杂交瘤细胞的沉降速率，定量描述了杂交瘤活细胞与死细胞之间的沉降速率差异，活细胞的沉降速率(15．5mm／h)大约是死细胞(9．36mm／h)的1．67倍，约是细胞碎片(1．46mm／h)的10倍；把该方法用于不同种类不同培养时期的脐血造血细胞，发现它们具有不同的沉降速率。这些数据将为细胞连续灌注培养过程的细胞截留研究提供依据。     

脐血干/祖细胞分离、冷冻和复苏技术

胎儿脐血作为富含ＣＤ３４＋细胞等造血干／祖细胞一个新来源,具有细胞增殖速度快,来源充足,收集安全等特点;脐血移植同样具有安全性好,效率高,费用低等优点。随着脐血干细胞移植临床应用的成功,欧美许多发达国家已经着手建立大规模脐血库以满足临床需求。建立脐血库技术上要求改善细胞冷冻保护剂组成,控制降温速率和细胞复苏方法,以获得理想的脐血干／祖细胞收率。同时由于脐血库液氮保存设备费用昂贵,需要预先分离脐血单个核细胞以减少样本冻存体积,以满足建库实际需求。