应用分子梳技术对DNA单分子的研究

分子梳技术是一种有效的拉伸DNA分子的手段,它利用流体流动过程中施加的力将DNA分子拉伸开并且平铺在固体表面上．在每个玻片上可以同时对很多DNA分子拉伸并且整齐地排列,使之便于统计分析数据．利用分子梳技术可以在单分子水平上研究DNA复制、转录过程以及DNA-蛋白质相互作用．文中主要介绍分子梳技术原理、实现方法及其重要应用．     

利用磁镊研究促旋酶与DNA的结合

促旋酶(gyrase)在原核生物的生命活动中扮演着重要的角色,它是已知拓扑异构酶中,唯一能够向DNA引入负超螺旋的酶.本文中,我们利用磁镊(magnetic tweezers)对促旋酶和DNA的相互作用进行了单分子实时观测.实验发现,在不加入ATP时,促旋酶能够同时与两段DNA(G片段和T片段)结合,但这种结合较弱,施加0.7pN的外力就能逐渐破坏两者的结合;但加入高浓度的诺氟沙星后,促旋酶与DNA的结合明显增强,甚至能够抗衡5.9pN的外力.促旋酶还会影响超螺旋的几何尺度:不加入促旋酶时,DNA超螺旋的几何尺度由DNA所受拉力决定,而加入促旋酶后,超螺旋DNA几何尺度变小,并且主要由DNA与促旋酶的相互作用而不再是所受拉力所决定.而且促旋酶与正负超螺旋的结合能力不同,它更容易与正超螺旋结合.同时,发现促旋酶从DNA上解离的时间符合双指数分布.我们提出的模型能够很好地解释这个分布,并与他人提出的模型的结果进行了比较.     

钙释放激活钙离子通道的发现及研究现状

Ca2+释放激活Ca2+(CRAC)通道是位于非兴奋性细胞质膜上的慢Ca2+通道,是非兴奋性细胞(尤其T淋巴细胞和HEK 293细胞)中胞外Ca2+进入细胞内的主要途径.Ca2+内流是T淋巴细胞激活的最重要的生理生化特征之一.Orai1蛋白单体是组成CRAC通道的亚基,4个Orai1蛋白亚基构成一个四聚体CRAC通道.内质网Ca2+浓度的降低使得STIM1发生定向运动并产生聚集,从而激活了CRAC通道.STIM1蛋白把内质网Ca2+的损耗与CRAC通道上的Ca2+内流联系起来,行使了Ca2+浓度感受器的功能.     

利用分子梳技术研究金属离子对DNA与组蛋白结合的影响

利用分子梳技术研究了一价(Na⁺, K⁺)、二价(Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺)金属离子对DNA与组蛋白结合的影响. 我们将λ-DNA分子、λ-DNA-组蛋白复合体在疏水表面上进行了拉伸, 用荧光显微镜直接观察加入金属离子后分子梳的变化. 结果表明: Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺导致DNA分子上的荧光有不同程度的衰减; Na⁺, K⁺在一定程度上抑制DNA与组蛋白的结合; Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺增强DNA与组蛋白的结合, 并能明显增加DNA与疏水表面的吸附; Mn²⁺容易导致DNA-组蛋白复合体聚集.     

RECQ5β解旋酶DNA退火特性的动力学研究

RecQ家族解旋酶对维持基因组完整性起着关键作用.许多RecQ家族解旋酶不仅可以打开双链及其他更复杂的DNA结构,而且有意思的是,还具有DNA退火活性.本文通过对DNA退火动力学、平衡态下DNA结合以及与单链DNA解离动力学的一系列测量,系统研究了RECQ5β的DNA退火特性.结果显示,在本研究的反应缓冲液条件下,在没有或存在不同的磷酸核苷因子(AMPPNP,ATPS或ADP)的情况下,当酶分子覆盖约40%~50%DNA单链时,RECQ5β催化的DNA退火效率最高.通过对RECQ5β1~662的比较研究证实,RECQ5β的C末端区域对该酶高的DNA退火活性是必不可少的.本文结果将有助于更好地理解RecQ家族解旋酶催化DNA退火的机理.     

利用荧光偏振研究二价金属离子对DNA与组蛋白结合的影响

利用荧光偏振实验我们研究了二价金属离子(Mn²⁺, Mg²⁺和Ca²⁺)对DNA与组蛋白结合的影响. 测量了二价金属离子(Mn²⁺, Mg²⁺和Ca²⁺)存在时, DNA和DNA-组蛋白的荧光偏振度. 结果表明, 组蛋白明显降低DNA分子的荧光偏振度; 二价金属离子显著增加DNA分子的荧光偏振度. 与DNA和组蛋白单独培育时相比较, 当二价金属离子、组蛋白、DNA共同培育时, DNA可与更多的组蛋白结合. Mn2+比其他二价离子(Mg²⁺和Ca²⁺)更容易使DNA-组蛋白复合体发生凝聚现象.