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建立缺陷型重组腺病毒载体介导的胸苷激酶基因治疗系统(Adtk/ACV),进行离休和活体治疗大鼠C6脑胶质瘤研究.将质粒pAdtk与pJM17共转染腺病毒包装细胞──293细胞,同源重组后制备纯化的Adtk并以PCR证实;Adtk对离休C6细胞的杀伤作用随着Adtk滴度和ACV剂量增加而增强,并有旁观者效应,而未转染C6细胞和AdLacZ转染C6细胞均未被杀伤;扫描电镜下见Adtk/ACV处理的细胞呈明显病理改变;ACV可有效杀伤Adtk/C6细胞.在大鼠脑立体定向仪引导下于右额叶接种2×106个C6细胞,分别于第3,6,8和10天原位注射Adtk,同时腹腔注射ACV(100mg/(kg·d-1)),3d组、6d组、8d组大鼠成活期在90d以上,组织学检查未发现肿瘤细胞.10d组成活期(28.5±4.6)d,而C6未治疗组和AdLacZ/ACV治疗组成活期分别为(1.8±3.1)d和(14.0±2.2)d.本文建立的Adtk/ACV在离体和活体水平对大鼠C6脑胶质瘤有强烈的杀伤作用,效果确实,应用方便,ACV价格便宜,有潜在临床应用价值. 相似文献
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目前基因治疗研究遇到的普遍问题是转染效率低下及目的基因蛋白在活体表达水平较低,其中解决目的基因表达较低的一个重要手段便是基因载体的改造。1990年,Jallat等人在转基因小鼠研究中发现:hFIX cDNA的表达量低,而其余一系列带有完整内含子Ⅰ或中间缺失4.8kb的内含子Ⅰ的转基因小鼠,其表达都和完整的Ⅸ因子表达相仿。这提示Ⅸ因子内含子Ⅰ顺序对其表达有一定的促进作用。1995年,Kurachi等人用含内含子Ⅰ片断的表达质粒转化HepG2细胞,发现瞬间表达要比cDNA高出7倍,其凝血活性和细胞内mRNA水平也有相应数量的提高。本实验室也进行了hFIX intron Ⅰ的研究工作,构建了逆转录病毒载体GlNaCi′IX,但对病毒上清进行RT-PCR检测,发现intron Ⅰ常被不同程度剪切。本文以SNMBAAIXm为蓝本,构建了反向表达载体GlNaPAi′IXBAM,其中Ⅸ因子转录方向与LTR转录方向相反,以期避免病毒包装中将intron Ⅰ剪切掉,使intron Ⅰ结构能够正确引入到靶细胞中,从而提高Ⅸ因子的表达量。 相似文献
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研究探索了VSV-G假型反转录病毒invivo途径基因治疗血友病B的可行性.采用新型包装细胞系293-GPG制备了VSV-G/G1NaBAⅨ假型病毒,该病毒的最高滴度可达8.5×108CFU·mL-1,与传统的反转录病毒相比具有更高抗补体灭活效应(P<0.001),并初步证实了新生鼠血清补体对VSV-G假病毒的灭活作用明显弱于成年鼠血清补体(P<0.01).不同剂量的病毒上清液经腹腔注入新生血友病B鼠后,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为(72.5±6.1)ng·mL-1,表达持续超过120d.治疗后小鼠的凝血功能均有一定程度的改善,以大剂量治疗组的改善最为明显,凝血活性提高至(3.4±1.5)%,APTT时间缩短至(43.6±7.2)s.hFⅨ的表达水平和凝血功能的改善程度与所用病毒的剂量呈正相关.治疗小鼠体内未检测到抗hFⅨ抗体,未发生任何治疗相关的毒副反应和生殖细胞的基因转移.研究结果表明,采用VSV-G假型反转录病毒开展新生血友病B小鼠invivo基因治疗是可供选择的有效方法. 相似文献
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构建了含pgk启动子驱动的HSV-tk基因的反转录病毒载体pLNTK,将HSV-tk基因转移至人脑胶质瘤SHG44细胞(命名为SHGLNTK)及小鼠黑色素瘤细胞B16(命名为B16LNTK).体外实验证实核着类似物ACV对SHGLNTK细胞和B16LNTK细胞的杀伤敏感性分别高于亲本细胞1000和400倍.转HSV-tk基因细胞与亲本细胞按不同比例共培养时,亲本细胞对ACV的敏感性明显增高,存在旁观者效应.首次应用人脑胶质瘤细胞株进行裸鼠体内实验,结果表明:ACV能完全抑制SHGLNTK细胞在裸小鼠体内肿瘤的形成,对裸小鼠体内已形成的SHGLNTK肿瘤的治疗效果与对照SHG44肿瘤相比,肿瘤体积缩小80%;用B16LNTK细胞接种同系C57/BL小鼠,经ACV治疗后,B16LNTK组小鼠的肿瘤较对照组B16肿瘤小95%.HSV-TK/ACV系统原位基因转移治疗SHG荷瘤裸小鼠、B16荷瘤小鼠,原位注射病毒悬液/ACV治疗组的SHG肿瘤、B16肿瘤分别较对照组肿瘤小50%,43%,原位注射PA317/LNTK细胞,ACV治疗的SHG肿瘤较对照组肿瘤小90%,以上实验结果,统计学上差异极显著,P<0.01.实验 相似文献
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检测化学物质潜在致癌性有多种比较灵敏的方法,其中有Ames法和哺乳动物细胞姐妹染色单体互换(SCE)法。我们用鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体检测系统鉴定为阳性的亚硝基胍(NTG)和阴性的焦亚硫酸钠,诱发中国仓鼠细胞姐妹染色单体互换,并以此为指标,鉴定其潜在致癌性。离体培养的中国仓鼠成纤维细胞株,同待检物质和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)混合培养24小时,BrdU最终浓度为每毫升培液15微克。细胞用0.075M KCl低渗处理,甲醇:冰醋酸(3:1)固定,制片。然后,基本按Korenberg等的方法处理,吉 相似文献
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烷基苯磺酸钠和烷基磺酸钠诱变能力的测定及其在中国仓鼠细胞中抑制由丝裂霉素C诱发SCE频率的观察 总被引:4,自引:0,他引:4
烷基苯磺酸钠(alkyl benzene sulfonate,ABS)和烷基磺酸钠(alkyl sulfonate,AS)是合成洗衣粉和洗涤剂的主要活性成分,其含量约占总量的30%以上.由于它广泛地应用于人们的日常生活中,特别是近年来更多地应用于清洗食具、蔬菜水果等食品,增加了直接进入人体的可能性,因此它的安全性日益引起人们的重视.郑富源曾用Ames法和微核测试法测定了烷基苯磺酸钠的致变效应,结果为阴性.这类阴离子型表面活性剂 相似文献
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我们用中国仓鼠Wg3-h和人体淋巴细胞作为亲本进行融合。两种细胞的自发融合频率低于10~(-7),但在灭活的仙台病毒媒介下可提高融合频率100倍。将促进融合后的细胞培养在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基中,只有含有次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的细胞才能存活。氨基喋呤的存在阻断了核酸的从头合 相似文献
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乳汁中分泌有活性的人凝血因子Ⅸ的转基因羊的研制 总被引:11,自引:0,他引:11
在人类内源性凝血系统中,活化的因子Ⅸ和因子Ⅷ、磷脂、钙离子相互作用,形成一种复合物,使凝血因子Ⅹ转变成活化的因子Ⅹ,促进凝血酶生成,从而在凝血过程中起重要作用.人凝血因子Ⅸ(humanfactorⅨ,hFⅨ)缺乏导致一种X_伴性遗传的出血性疾病血友病B,发病率为1/100000[1].血友病B的治疗目前主要靠替代疗法,即注射正常人血浆制剂以补充患者所缺乏的FⅨ.然而,这种疗法存在着血液来源困难以及从供血者传染肝炎病毒、爱滋病病毒等致病因子的危险,故生产“无毒”的hFⅨ制剂长期以来是人们的迫切愿望.虽然通过重组DNA技术已… 相似文献
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经凝胶过滤和亲和层析分离得到的人抗血友病A因子——VIII因子抗原VIII:CAg,在用一期法和火箭免疫电泳证实其纯度后,免疫Balb/c小鼠和包被免疫测定板。采用常规鼠杂交瘤技术经间接ELISA法筛选、克隆化得到四个稳定分泌抗VIII:C的单克隆抗体的细胞株,即DC8,DE4,DE7和DE8,腹水效价为1:1×10~4~1:1×10~5,一期法抑制反应表明,单克隆抗体对VIII:C活性有显著的抑制作用,但其抑制是不完全的,对抗体进行了纯化及分析,并将单抗用于血友病A多态性的分析。 相似文献
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用双抗体夹心ELISA法测定人凝血因子IX蛋白。在转入了外源人凝血因子IX基因的CHO细胞和HSF细胞的培养液中均测得一定量的IX因子蛋白,其量相当于正常人血浆IX因子蛋白的0.89%~3.81%,而对照细胞均为阴性结果。对一例血友病B患者(IX:C<0.1%)的分析结果表明,其血浆中含有的IX因子蛋白量相当于正常人的52.3%,因而将此病例归属于血友病B~R型。本法灵敏度高、特异性强、重复性好,可与一期法相互补充,应用于临床血友病B的诊断、分类、家系分析及携带者的检出。 相似文献