转有人凝血因子IX cDNA的家兔成纤维细胞在家兔体内的高效表达和检测

凝血因子Ⅸ(简称Ⅸ因子)是人体内凝血系统的重要成分之一.它的缺乏或功能缺陷可导致血友病B的发生。近年来,随着高效安全的基因转移技术迅速发展,血友病B的基因治疗已取得突破性进展,逐渐从实验室走向临床试验阶段,并已获得了令人可喜的成果.在血友病B的基因治疗研究中,我们构建了人凝血因子Ⅸ cDNA的双拷贝病毒载体(double-copy     

尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅰ与活化凝血因子Ⅹ的结合特性

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅰ在抗凝血反应中存在一临界浓度(12 nmol/L), 只有在高于其临界浓度时, 才表现出显著的抗凝血活性. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法, 发现抗凝血因子Ⅰ与活化凝血因子Ⅹ在钙离子作用下形成1:1的复合物, 从而延长凝血时间. 天然抗凝血因子Ⅰ和脱钙抗凝血因子Ⅰ在没有钙离子存在条件下均不能与活化凝血因子Ⅹ形成复合物. 锶离子也可以使二者结合, 而钡离子和铽离子均不能使两者结合. 抗凝血因子Ⅰ是凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合蛋白家族中一个新发现的成员, 其分子量为29 603.6 u, 分子中两条肽链分子量十分接近, 约为14.7 ku. 抗凝血因子Ⅰ是由251个氨基酸残基组成的, 其氨基酸组成与这一家族中其他成员十分相似.     

Ⅸ因子重组质粒的构建及其转化细胞移植在小鼠体内的表达

血友病B是由于凝血因子Ⅸ缺乏所致的一种严重出血性遗传病,其临床治疗主要依靠输血或补充人Ⅸ因子浓缩制剂,但这种替代疗法不仅疗效短,费用昂贵,而且使患者面临着爱滋病毒及肝炎病毒感染的威胁。目前,利用基因转移技术进行遗传病基因治疗的研究已取得令人注目的进展。在先前的血友病B基因治疗的研究中,我们构建了几个带有不同启动子控制     

人类巨细胞病毒启动子控制的人Ⅸ因子cDNA在人体细胞中的高效表达

凝血因子Ⅸ(简称Ⅸ因子)是人体内凝系统的重要成分之一,它的缺乏或功能缺陷可导致血友病B.在血友病B基因治疗的研究中,如何提高Ⅸ因子蛋白的产量是关键问题之一。在以前的研究中,我们比较了SV40早期启动子、小鼠金属硫基因蛋白启动子和Moloney小鼠白血病病毒LTR启动子的作用。为进一步提高Ⅸ因子基因在培养细胞特别是人     

携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究

构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因（ｈⅨＲ３３８Ａ）及不同调控元件的腺相关病毒 表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后, 以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的ｒＡＡＶ/ＨＳＶ杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制 备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重 组病毒滴度达 １．２５ × １０１２病毒颗粒／ｍＬ,然后,利用这一重组病毒,对ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ进行离体及在体表达, 获得了 ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ在肌细胞系 Ｃ２Ｃ１２及血友病 Ｂ小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达（２５５１．３２± ９２．１４）ｎｇ·（１０６细胞）－１·（２４ｈ）－１及４６３．２８ｎｇ·ｍＬ－１,与野生型Ⅸ因子的表达水平（２５６５．７６±６４．３６）ｎｇ· （１０６细胞）－１·（２４ ｈ）－１及４５３．９２ ｎｇ· ｍＬ－１无显著性差异．然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的 ２．４６倍.．将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病 Ｂ基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装 系统──ｒＡＡＶ／ＨＳＶ杂合病毒包装系统──在重组ＡＡＶ载体大量制备中的应用     

人凝血因子Ⅸ基因在中国仓鼠卵巢细胞中的转移及表达

凝血因子Ⅸ(简称Ⅸ因子)是人体内凝系统的重要成分之一,它的缺失或功能缺陷可导致出血性疾病——血友病B。Ⅸ因子由肝脏产生,在翻译后需经过一系列依赖维生素K的复杂修饰过程才能形成有活性的Ⅸ因子。因此,一般认为肝外组织不能产生有凝血活性的Ⅸ因子。自1982年以来,国外几个实验室相继克隆了人Ⅸ因子cDNA,并发现,在维生     

人凝血因子Ⅸ基因pKG_5—Ⅸ直接注入小鼠骨骼肌中瞬间表达的研究

血友病 B 是由于凝血因子 IX 缺乏所致的一种严重出血性疾病.年发病率大约30万分之一.血友病 B 临床治疗主要靠输血或补充人 IX 因子浓缩剂.但经常输血不仅费用昂贵,而且使患者面临着爱滋病病毒及肝炎病毒感染的威胁.自1982年人凝血因子 IX     

尖吻蝮蛇毒抗凝血因子I与活化凝血因子X的结合特征

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子在抗凝血反应中存在一临界浓度(12 nmol/L), 只有在高于其临界浓度时, 才表现出显著的抗凝血活性. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法, 发现抗凝血因子与活化凝血因子在钙离子作用下形成1︰1 的复合物, 从而延长凝血时间. 天然抗凝血因子和脱钙抗凝血因子在没有钙离子存在条件下均不能与活化凝血因子形成复合物. 锶离子也可以使二者结合, 而钡离子和铽离子均不能使两者结合. 抗凝血因子是凝血因子或凝血因子结合蛋白家族中一个新发现的成员, 其分子量为29 603.6 u, 分子中两条肽链分子量十分接近, 约为 14.7 ku. 抗凝血因子是由251 个氨基酸残基组成的, 其氨基酸组成与这一家族中其他成员十分相似.     

hB1F与HNF1协同调控HBV增强子Ⅱ的功能

人Ｂ１结合因子（ｈｕｍａｎ Ｂ１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ,ｈＢ１Ｆ）是本实验室克隆到的一个新的转录因子,它能够结合于ＨＢＶ增强子Ⅱ（ＥＮⅡ）的Ｂ１区并反式激活其功能,对ｈＢ１Ｆ和其他反式激活ＥＮⅡ的肝细胞核因子间在功能上的相互关系进行了研究。氯霉素乙酰转移酶（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＣＡＴ）报告基因分析发现,ｈＢ１Ｆ与ＨＮＦ３β,ＨＮＦ４间在激活Ｅ     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

利用精原干细胞建立人凝血因子Ⅸ转基因小鼠

用玻璃针将Effectene^TM包裹的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达载体注入小鼠的曲精细管. 通过PCR和Southern印迹法对子代41只小鼠进行鉴定, 有2只小鼠的基因组中整合有hFⅨ基因表达框架, 整合率为4%(2/41). 通过ELISA方法在其中1只小鼠的血浆中检测到hFⅨ的表达, 表达量为4.6 ng/mL. 实验证明, 精原干细胞法是建立转基因动物的有效途径, 为乳腺反应器的研究提供了另一个技术手段. 同时也为通过生殖细胞途径治疗血友病B提供了新的选择.     

VSV-G假型反转录病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在新生血友病B小鼠中的有效转移和表达

研究探索了VSV-G假型反转录病毒invivo途径基因治疗血友病B的可行性.采用新型包装细胞系293-GPG制备了VSV-G/G1NaBAⅨ假型病毒,该病毒的最高滴度可达8.5×108CFU·mL-1,与传统的反转录病毒相比具有更高抗补体灭活效应(P<0.001),并初步证实了新生鼠血清补体对VSV-G假病毒的灭活作用明显弱于成年鼠血清补体(P<0.01).不同剂量的病毒上清液经腹腔注入新生血友病B鼠后,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为(72.5±6.1)ng·mL-1,表达持续超过120d.治疗后小鼠的凝血功能均有一定程度的改善,以大剂量治疗组的改善最为明显,凝血活性提高至(3.4±1.5)%,APTT时间缩短至(43.6±7.2)s.hFⅨ的表达水平和凝血功能的改善程度与所用病毒的剂量呈正相关.治疗小鼠体内未检测到抗hFⅨ抗体,未发生任何治疗相关的毒副反应和生殖细胞的基因转移.研究结果表明,采用VSV-G假型反转录病毒开展新生血友病B小鼠invivo基因治疗是可供选择的有效方法.     

乳腺表达人凝血因子Ⅸ的转基因小鼠的研究

通过正压手动显微操作技术,将能在离体细胞和活体细胞表达的人凝血因子Ⅸ的表达载体ｐＭＣⅨｍＤＮＡ导入５８６枚昆明白种小鼠受精卵,随后将显微注射后存活的４９９枚受精精卵移植于假孕受体母鼠,获得２１６只Ｆ０代仔鼠。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂产分析证实有６只仔鼠的基因组中有外源基因阳性整合,整合率为３％;ＥＬＩＳＡ测定２只Ｆ０代转基因雌鼠的乳汁中人凝血因子Ⅸ蛋白的含是均已达１００ｎｇ／ｍｌ一期法测定其     

基因疗法与血友病

基因疗法与血友病人类自诞生以来，无论是平民百姓还是皇亲国戚．都遭受过内出血──血友病一的折磨。这个星期．一科学小组报告，他们用基因疗法治疗了狗的Ｂ型血友病。人类遗传有这种病的约占三万分之一。Ｂ型血友病通常遗传给男性．这些患者体内缺乏凝血蛋白ＩＸ因子。...     

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 10¹² vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 10¹¹ vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.     

尖吻蝮蛇毒抗凝血因子I与活化凝血因子X的结合特征

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ｉ在抗凝血反应中存在一临界浓度（１２ ｎｍｏｌ／Ｌ）,只有在高于其临界浓度时,才表现出显著的抗凝血活性．用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,发现抗凝血因子Ｉ与活化凝血因子Ｘ在钙离子作用下形成１：１的复合物,从而延长凝血时间．天然抗凝血因子Ｉ和脱钙抗凝血因子Ｉ没有钙离子存在条件下均不能与活化凝血因子Ｘ形成复合物．锶离子也可以使二者结合,而钡离子和铽离子均不能使两者结合．抗凝血因子Ｉ是凝血因子ＩＸ或凝血因子Ｘ结合蛋白家族中一个新发现的成员,其分子量为 ２９６０３．６ _ｕ,分子中两条肽链分子量十分接近,约为 １４．７ｋｕ．抗凝血因子Ｉ是由２ ５１个氨基酸残基组成的,其氨基酸组成与这一家族中其他成员十分相似．     

尾静脉大容量快速注射法介导的人凝血因子Ⅸ基因在小鼠肝内的高效表达

尾静脉大容量快速注射裸质粒DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达, 采用此方法将人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达质粒pCMV-hFⅨ 2.2 mL于7 s内导入小鼠体内, hFⅨ在小鼠体内表达水平最高为2921 ng/mL(血浆). hFⅨ表达水平与裸质粒DNA注射剂量呈正相关, 重复注射的hFⅨ表达水平偏低(最高1459 ng/mL). PCR检测发现小鼠多种器官中存在hFⅨ cDNA, RT-PCR和免疫组化切片检测表明, hFⅨ mRNA和蛋白主要在肝脏中表达. 转氨酶水平与病理切片检测表明, 注射1 d后5%的肝脏细胞受到损伤, 但在3 ~ 10 d内恢复. 研究结果表明, 尾静脉大容量快速注射法能够介导hFⅨ在小鼠体内高水平表达, 为基因治疗研究提供了一项简便而实用的动物实验手段.     

中国血友病B生物基因治疗研究状况

血友病B为一种严格的X连锁隐性遗传病, 由于其单纯的分子遗传基础和明确的临床表现, 容易观察疾病治疗的效果; hFⅨ较小的基因规模可以适用于几乎所有的常用基因载体系统. 在多种细胞均可以获得有效的表达使得基因治疗时可以有广泛的细胞选择范围, 同时也为生物工程制备重组蛋白药物提供了便利. 而且, 血友病B有天然和基因操作形成的动物模型便于治疗的临床前实验研究. 基于上述理由, 血友病B一直是遗传病基因生物治疗和重组蛋白药物制备的重要模型. 我国在20世纪90年代成功完成了基因治疗血友病B的临床试验, 对推进我国的基因治疗起到重要作用. 本文简述我国在血友病B的生物基因治疗方面的研究情况与发展方向, 希望为基因治疗和重组蛋白药物研究人员提供参考.     

含有人凝血因子Ⅸ自身内含子Ⅰ的反向逆转录病毒载体构建及表达

目前基因治疗研究遇到的普遍问题是转染效率低下及目的基因蛋白在活体表达水平较低,其中解决目的基因表达较低的一个重要手段便是基因载体的改造。1990年,Jallat等人在转基因小鼠研究中发现:hFIX cDNA的表达量低,而其余一系列带有完整内含子Ⅰ或中间缺失4.8kb的内含子Ⅰ的转基因小鼠,其表达都和完整的Ⅸ因子表达相仿。这提示Ⅸ因子内含子Ⅰ顺序对其表达有一定的促进作用。1995年,Kurachi等人用含内含子Ⅰ片断的表达质粒转化HepG2细胞,发现瞬间表达要比cDNA高出7倍,其凝血活性和细胞内mRNA水平也有相应数量的提高。本实验室也进行了hFIX intron Ⅰ的研究工作,构建了逆转录病毒载体GlNaCi′IX,但对病毒上清进行RT-PCR检测,发现intron Ⅰ常被不同程度剪切。本文以SNMBAAIXm为蓝本,构建了反向表达载体GlNaPAi′IXBAM,其中Ⅸ因子转录方向与LTR转录方向相反,以期避免病毒包装中将intron Ⅰ剪切掉,使intron Ⅰ结构能够正确引入到靶细胞中,从而提高Ⅸ因子的表达量。     

基于对称差的Fuzzy度量及收敛问题

Ｆｕｚｚｙ数是Ｆｕｚｚｙ数学中应用最为广泛的内容之一.本文从λ截集的对称差集合的Ｌｅｂｅｓｇｕｅ测度出发,引进衡量Ｆｕｚｚｙ数之间差异的一致对称差度量ｄΔ及Ｐ平均对称差度量ｄΔＰ,弥补了现行文献中以Ｈａｕｓｄｏｒｆｆ度量为基础所建立的Ｆｕｚｚｙ数之间的差异度量不适用于某些实际问题的不足.这对Ｆｕｚｚｙ数理论的进一步发展具有明显意义.设Ｒ为实数域,Ｅ1为Ｆｕｚｚｙ数空间[1];Ａ～∈Ｅ1,Ａλ表示Ａ～的λ截集并约定Ａ0为Ａ～的支集的闭包;Ａ,ＢＲ,Ａ与Ｂ的对称差集合记为ＡΔＢ=(Ａ-Ｂ)∪(Ｂ-Ａ);ｍ表示Ｌｅｂｅｓｇｕ…