类人胶原蛋白基因工程菌高密度发酵过程控制

目的优化基因工程菌Escherichia coli BL 21生产人源型胶原蛋白的高密度发酵工艺。方法建立一套以溶解氧浓度和比生长速率为中心的控制策略,采用溶氧反馈或pH反馈调节补料速度。结果 OD600可达150,胶原蛋白的表达量为9g／L。结论 20％-30％饱和度的溶解氧和0．1- 0．2 h-1的比生长速率有利于细胞生长和产物表达,其与降低乙酸等有害代谢副产物的积累密切相关。     

类人胶原蛋白工程菌质粒稳定性研究

目的研究基因重组大肠杆菌补料分批发酵生产类人胶原蛋白过程中质粒稳定性。方法通过平板复制法,观察质粒稳定性在不同生长周期、卡那霉素浓度和不同比生长速率中的变化。结果质粒稳定性受生长周期、卡那霉素和比生长速率的影响。在μ为0.15、卡那霉素浓度为0.005g/L的情况下,工程菌生产效率最理想。结论通过控制发酵过程中的质粒稳定性可以有效地提高菌体产量和目标蛋白产量。     

改进Ferrozine法测定溶液中的二价铁、三价铁及总铁

铁元素是自然界中常见的微量元素之一,其在溶液中存在亚铁离子、三价铁离子两种价态。为了准确地定量测定亚铁、三价铁及总铁的含量,探索出一种改进的菲啰嗪(Ferrozine)法。二价铁和Ferrozine反应生成紫色络合物,其在562 nm处有最大吸收峰。利用该特点,可以直接测定二价铁含量,以盐酸羟胺为还原剂,将三价铁还原为二价铁后,即可测定总铁含量,进一步计算出三价铁含量。结果表明:该方法能准确测定游离二价铁及总铁,测定结果和ICP-AES法的结果吻合,同时三价铁计算结果和黄血盐测定三价铁的结果吻合;并且该方法可用于预测分散在水相的四氧化三铁纳米颗粒的铁含量,与ICPAES法相比,校正系数约为0.85。因此该方法适用性广,操作简单而经济,结果准确。     

真菌绿原酸的生物合成途径解析及调控策略

绿原酸具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等生物学功能。为提高真菌中绿原酸的生物合成量,实现真菌的提质增效,本文综合分析植物与真菌绿原酸的生物合成过程及其异同,绘制了绿原酸的生物合成途径;比较目前提高绿原酸合成量的方法,发现逆环境胁迫是积累绿原酸的关键。在培养真菌的过程中,可通过UV-B处理、增加光照强度、适当的光照时长、蓝光照射、低温胁迫、干旱胁迫等物理处理来调控其生长代谢,或者施加外源激素或转录因子刺激绿原酸生物合成途径中关键调节酶的过量表达,如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰基转移酶(HCT)及羟基化肉桂酰转移酶(C3H)等,这些酶的过表达可增加绿原酸生物合成途径的流通量,进而提高真菌中绿原酸的含量。     

类人胶原蛋白基因工程菌诱导后比生长速率优化

目的优化类人胶原蛋白基因工程菌高温诱导后的比生长速率。方法通过分析不同比生长速率下发酵液中菌体浓度、类人胶原蛋白浓度、细胞得率系数(YX/S)、产物得率系数(YP/S)的变化,确定诱导后的最佳比生长速率。结果当比生长速率为0.04～0.05h-1,细胞浓度和类人胶原蛋白的浓度分别可达69.5g/L(DCW)和13.8g/L。结论诱导后的比生长速率对细胞生长、类人胶原蛋白的合成均产生显著性影响。     

重组大肠杆菌分批-补料培养生产类人胶原蛋白的过程控制

目的优化重组大肠杆菌高密度发酵的调控工艺。方法通过考察比生长速率、3种控氧方式以及诱导强度对细胞和类人胶原蛋白产量的影响,确定最佳的发酵工艺。结果比生长速率显著影响类人胶原蛋白的产量,且最适比生长速率为0.15～0.20h-1;在提高罐压的条件下,细胞和类人胶原蛋白的浓度均显著高于其他两种控氧方式,充入富氧空气的细胞和类人胶原蛋白的浓度均最低;诱导强度对细胞生长和蛋白质表达的影响非常大,当细胞浓度达47±2g/L(DCW)时,开始升温至42℃进行诱导,最佳条件为42℃保温2～3h,然后降温至39℃继续培养5～6h。结论通过优化重组大肠杆菌分批补料培养生产类人胶原蛋白的工艺,使得细胞和类人胶原蛋白浓度分别达68.94g/L(DCW)和13.02g/L。     

秸秆微生物降解及发酵生产乙醇的研究

目的 研究提高微生物降解秸秆的产糖率及利用秸秆降解物发酵生产乙醇的产率.方法 利用单一微生物纯培养和多种微生物混合培养降解秸秆产生可发酵糖,并对秸秆降解物采用非等温同时糖化发酵法(nonisothermal simultaneous saccharification and fermentation,NSSF)和同步糖化发酵法(simultaneous saccharification and fermentation,SSF)进行发酵生产乙醇.结果 采用黑由霉和康宁木霉混合培养降解秸秆时的纤维素酶活力显著高于其他5种降解形式,CMC糖化力(CM-CA)可达到3676U,滤纸糖化力(FPA)可达到680U;采用NSSF法发酵的乙醇产率显著高于采用SSF法发酵的乙醇产率,其最高可达到0.14 g/gDS.结论 采用黑曲霉和康宁木霉混合培养降解秸秆,并采用NSSF法进行发酵生产乙醇,与直接用酶降解秸秆发酵生产乙醇的产率相当,但是成本低于采用商品化的酶.     

响应面法优化一种新型类人胶原蛋白发酵培养基

目的 借助于MINITAB统计学软件,采用Plackett-Burman设计和响应面优化法对基因工程菌Escherichia coli BL21发酵生产类人胶原蛋白的原始培养基进行优化研究.方法 首先利用 Plackett-Burman设计筛选出对类人胶原蛋白产量影响显著的3个因素,即葡萄糖甘油1:4混合碳源、酵母粉和硫酸铵.在此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,找到后续实验的中心点.再利用Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析,确定主要影响因素的最佳水平.结果 优化后的3种主要影响成分为葡萄糖甘油1:4,混合碳源12.24 g/L,硫酸铵7.12 g/L,酵母粉5.53g/L.结论 方程拟合良好,优化后的培养基发酵产量经摇瓶和发酵罐验证,产量分别为5.91g/L和6.12g/L,较优化前分别提高了306%和296%.     

固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白

目的 研究利用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的洗脱方法 ,以优化分离纯化的条件.方法 将吸附了重组类人胶原蛋白的层析柱采用降低pH,增大离子强度和增大NH4Cl浓度3种方法 进行洗脱.结果 采用增大NH4Cl浓度的方法 进行洗脱所得的洗脱峰面积最大,洗脱体积最小,纯化后重组类人胶原蛋白的纯度达97.9%,回收率为68.6%,纯化倍数为2.78.结论 采用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白是可行的,可有效地对重组类人胶原蛋白进行纯化.