类人胶原蛋白基因工程菌高密度发酵过程控制

目的优化基因工程菌Escherichia coli BL 21生产人源型胶原蛋白的高密度发酵工艺。方法建立一套以溶解氧浓度和比生长速率为中心的控制策略,采用溶氧反馈或pH反馈调节补料速度。结果 OD600可达150,胶原蛋白的表达量为9g／L。结论 20％-30％饱和度的溶解氧和0．1- 0．2 h-1的比生长速率有利于细胞生长和产物表达,其与降低乙酸等有害代谢副产物的积累密切相关。     

类人胶原蛋白工程菌质粒稳定性研究

目的研究基因重组大肠杆菌补料分批发酵生产类人胶原蛋白过程中质粒稳定性。方法通过平板复制法,观察质粒稳定性在不同生长周期、卡那霉素浓度和不同比生长速率中的变化。结果质粒稳定性受生长周期、卡那霉素和比生长速率的影响。在μ为0.15、卡那霉素浓度为0.005g/L的情况下,工程菌生产效率最理想。结论通过控制发酵过程中的质粒稳定性可以有效地提高菌体产量和目标蛋白产量。     

重组类人胶原蛋白Ⅱ仿生人工骨材料的制备

目的 采用重组类人胶原蛋白Ⅱ(recombinant human-like collagen Ⅱ,RHLCⅡ)制备仿生人工骨复合材料,并对复合材料进行研究.方法 采用相分离一冷冻干燥法制备RHLCⅡ复合材料;利用扫描电镜、透射电镜、X射线衍射仪、红外光谱仪和万能电子材料实验机对材料的理化性能进行表征;选择急性毒性实验、溶血实验、皮内实验和热原实验对材料的生物相容性进行评价.结果 RHLCⅡ复合材料在晶相组成、化学组成和晶体尺寸方面均类似于天然骨,抗压强度和弹性模量介于致密骨和牙本质之间;复合材料的急性毒性实验、溶血实验、皮内实验和热原实验均为阴性.结论 RHLCⅡ复合材料具有良好的理化性质和生物相容性,有望成为培养自体成骨细胞的理想支架材料.     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白分离与纯化

目的 研究重组类人Ⅰ型胶原蛋白基因工程的下游工艺。方法工程菌株Escherichia coli BL213．1在Bioengineering L1 523型12．8L自控发酵罐中经24h发酵，细胞干重达到77．3g/L，表达量为菌体蛋白量的29．4％。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后，依次经DEAE52，Sephadex G100柱层析分离纯化。结果最终产物纯度达到98％，回收率为80．5％。结论纯化的类人Ⅰ型胶原蛋白经SDS-PAGE电泳测定为电泳纯，分子质量为90ku，N端序列为NH2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G，与基因序列设计一致。     

类人胶原蛋白基因工程菌诱导后比生长速率优化

目的优化类人胶原蛋白基因工程菌高温诱导后的比生长速率。方法通过分析不同比生长速率下发酵液中菌体浓度、类人胶原蛋白浓度、细胞得率系数(YX/S)、产物得率系数(YP/S)的变化,确定诱导后的最佳比生长速率。结果当比生长速率为0.04～0.05h-1,细胞浓度和类人胶原蛋白的浓度分别可达69.5g/L(DCW)和13.8g/L。结论诱导后的比生长速率对细胞生长、类人胶原蛋白的合成均产生显著性影响。     

秸秆微生物降解及发酵生产乙醇的研究

目的 研究提高微生物降解秸秆的产糖率及利用秸秆降解物发酵生产乙醇的产率.方法 利用单一微生物纯培养和多种微生物混合培养降解秸秆产生可发酵糖,并对秸秆降解物采用非等温同时糖化发酵法(nonisothermal simultaneous saccharification and fermentation,NSSF)和同步糖化发酵法(simultaneous saccharification and fermentation,SSF)进行发酵生产乙醇.结果 采用黑由霉和康宁木霉混合培养降解秸秆时的纤维素酶活力显著高于其他5种降解形式,CMC糖化力(CM-CA)可达到3676U,滤纸糖化力(FPA)可达到680U;采用NSSF法发酵的乙醇产率显著高于采用SSF法发酵的乙醇产率,其最高可达到0.14 g/gDS.结论 采用黑曲霉和康宁木霉混合培养降解秸秆,并采用NSSF法进行发酵生产乙醇,与直接用酶降解秸秆发酵生产乙醇的产率相当,但是成本低于采用商品化的酶.     

响应面法优化一种新型类人胶原蛋白发酵培养基

目的 借助于MINITAB统计学软件,采用Plackett-Burman设计和响应面优化法对基因工程菌Escherichia coli BL21发酵生产类人胶原蛋白的原始培养基进行优化研究.方法 首先利用 Plackett-Burman设计筛选出对类人胶原蛋白产量影响显著的3个因素,即葡萄糖甘油1:4混合碳源、酵母粉和硫酸铵.在此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,找到后续实验的中心点.再利用Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析,确定主要影响因素的最佳水平.结果 优化后的3种主要影响成分为葡萄糖甘油1:4,混合碳源12.24 g/L,硫酸铵7.12 g/L,酵母粉5.53g/L.结论 方程拟合良好,优化后的培养基发酵产量经摇瓶和发酵罐验证,产量分别为5.91g/L和6.12g/L,较优化前分别提高了306%和296%.     

类人胶原蛋白基因工程茵高密度发酵过程控制

目的优化基因工程菌Escherichia coli BL21生产人源型胶原蛋白的高密度发酵工艺。方法建立一套以溶解氧浓度和比生长速率为中心的控制策略，采用溶氧反馈或pH反馈调节补料速度。结果OD600可达150，胶原蛋白的表达量为9g／L。结论20％～30％饱和度的溶解氧和0．1-0．2h^-1的比生长速率有利于细胞生长和产物表达，其与降低乙酸等有害代谢副产物的积累密切相关。     

脐静脉内皮细胞的提取与形态学观察

目的 获取胶原酶灌注法提取脐静脉内皮细胞的有效方法.探讨内皮细胞培养过程中生长因子的添加浓度,并对内皮细胞进行形态学观察及鉴定.方法 采用血球计数法对在不同时间和不同胶原酶浓度下提取的脐静脉内皮细胞进行计数.同时采用MTT法探讨了生长因子(Endothe-lia Cells Growth Supplement,ECGS)的浓度对脐静脉内皮细胞生长的作用,并用倒置显微镜和HE染色法观察了脐静脉内皮细胞的形态,Ⅷ因子免疫组化对获取的脐静脉内皮细胞进行鉴定.结果 当提取时间为10～30 min时,随着时间的增加,内皮细胞的提取数量增加;当胶原酶的浓度为0.1%～0.3%时,消化的脐静脉内皮细胞数量逐渐增加.ECGS的浓度为30μg/mL时,促进脐静脉内皮细胞的生长,种植4天后细胞进入平台期.脐静脉内皮细胞体外培养形态为"铺路石"状.Ⅷ因子免疫组化鉴定为阳性.结论 胶原酶灌注法是一种快速而有效的获取血管内皮细胞的方法,可以为组织工程血管内皮化提供充足的种子细胞.