烟曲霉脂肪酶B在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

从烟曲霉Aspergillus fumigatus GIM3.20中克隆获得了一种脂肪酶B基因(AFLB)。通过序列比对,发现AFLB与南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列有31%的一致性,两者同属CALB家族脂肪酶；AFLB 含有与家族其他成员类似的保守五肽序列(SWSQG),预测AFLB的催化三联体分别为S233、D318和H361,其中Ser233位于保守五肽序列中；此外AFLB含有一段N-端延长序列(由第1~128位氨基酸组成),是曲霉属脂肪B的特有序列。在毕赤酵母中成功地异源表达了脂肪酶AFLB,并通过亲和层析进行了纯化。SDS电泳结果显示,该酶存在部分高度N-糖基化和部分无糖基化的两种形态,对应分子量分别为45~66kDa和42kDa。酶学性质表征结果显示,重组脂肪酶AFLB最适反应pH 值为7.0,最适反应温度为40℃,并在50℃以下具有较好稳定性,其最适底物为肉豆蔻酸对硝基苯酯。脂肪酶AFLB与CALB有高度亲缘性,具有潜在的工业应用前景。     

烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维同源结构建模及其分子对接研究

探究烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶活性位点的结构特征.首次采用同源建模的方法构建了烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维结构,并通过Ramachandran和Profile-3D图验证了模型的可靠性.然后,利用已知的共结晶配体结构,准确定位了14α-去甲基化酶的活性位点,让伏立康唑与靶点进行对接.通过柔性分子对接方法首次阐明了14α-去甲基化酶抑制剂与靶酶活性位点的相互作用模式,明确了14α-去甲基化酶与该类抑制剂结合时起重要作用的氨基酸残基.本研究为基于烟曲霉14α-去甲基化酶三维结构的药物靶点设计提供重要的参考信息,同时也为抗真菌药的发展奠定坚实的理论基础.     

本期导读

正为了节省读者的宝贵时间,从第二期开始,我刊特别增加本期导读。我国历史上并没有团水虱致死红树林的记载,可近两年来海南和广西频繁报道红树林受团水虱危害连片死亡的事件。据初步统计,至2013年团水虱危害我国的红树林面积已达535亩,其中部分发育良好的林子枯死。团水虱通过钻孔穴居在红树林体内,造成树根和树干的千疮百孔,中断植物体的水分与营养传输,导致植株的枯死。团水虱具有抗逆性强、繁殖迅速、消杀和防控难度大等特点,红树林一旦遭受其高密度的攻击死亡率近乎100%。国内外有关红树林团     

海洋烟曲霉菌产壳聚糖酶的酶学性质初探

对海洋烟曲霉菌产壳聚糖酶的酶学性质进行初步研究,在不同温度、不同pH值的反应系统中,考察酶活随温度、pH值的变化情况.在适宜的温度和pH值条件下,向反应体系中添加一定浓度的金属离子,了解金属离子对酶的作用效果.实验结果表明:该酶适宜的催化反应温度为30～35℃、pH值为6.0,当温度为30～35℃时,保持30 min具有一定的热稳定性;金属离子Mn2+对壳聚糖酶具有较大的激活作用.     

烟曲霉素生物素标记衍生物的合成及体外测试

为了深入研究烟曲霉素及其衍生物的作用机理，合成了烟曲霉素的生物素标记衍生物6。化合物6是以辛二胺为连接臂通过酰胺键和氨基甲酸酯键把烟曲霉素的衍生物Fumagillol（compound2）和生物素连接而成，各中间体和目标化合物均经^1HNMR、^13CNMRMS表征，结构正确。体外活性测试结果表明目标化合物6可以高效的并且细胞选择性的抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖。体外受体结合实验证明化合物6与人甲硫氨酸氨肽酶-2（MetAP2）有很高的亲和力。     

改性烟曲霉对刚果红的去除动力学、等温线及机制

将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)修饰前后的灭活烟曲霉菌丝体用于对阴离子偶氮染料刚果红的脱色,结果表明改性前烟曲霉菌丝体(AFB)和改性后的烟曲霉菌丝体(MAFB)均可有效去除染料溶液中刚果红.整个吸附过程的动力学过程符合伪二阶动力学模型,吸附数据符合Freundlich等温线模型,表明为多层吸附.采用不同的化学反应封闭烟曲霉的氨基、羧基以及羟基,结果表明烟曲霉氨基是吸附刚果红(CR)的主要基团,而羟基和羧基则起着一定的作用.烟曲霉菌丝对刚果红的脱色机理主要是零电荷点以下pH时,生物吸附剂的氨基、羟基和羧基发生质子化,带正电荷生物吸附剂与带负电荷CR通过静电吸引而被吸附,其次,吸附剂上的氨基、羟基和羧基与刚果红之间形成氢键而进一步被吸附;而零电荷点以上pH时,则主要通过形成氢键进行吸附.     

糖基化影响真菌植酸酶的胰蛋白酶耐受性

通过重叠聚合酶链式反应,将黑曲霉植酸酶(Aspergillus niger NRRL 3135phytase)第238~337位与第382~444位多肽片段的基因编码序列替换为烟曲霉植酸酶(Aspergillus fumigatus ATCC 13073phytase)中的对应序列,构建片段置换植酸酶(Fragments-replaced phytase)基因.将插入该基因的pGAPZαA重组质粒转化入毕赤酵母.通过离子交换与凝胶过滤纯化,获得重组酵母分泌的活性片段置换植酸酶.与黑曲霉植酸酶相比,片段置换显著提高了片段置换植酸酶的胰蛋白酶耐受性.而通过脱糖基化酶PNGase彻底去除N-糖基化,可恢复片段置换植酸酶对胰蛋白酶的敏感性.上述结果表明烟曲霉植酸酶对应片段上的N-糖基化修饰可显著提高毕赤酵母表达的黑曲霉植酸酶的胰蛋白酶耐受性.     

一株纤维素降解菌的分离、鉴定及降解特性初步研究

从长沙宁乡灰汤温泉附近的水样中分离获得1株具有较强纤维素降解能力的菌株,命名为NX1-1,该菌株最适生长温度为40℃,最适生长pH5.0~8.0.菌株形态学以及ITS rDNA和28S rDNA D1/D2序列分析的鉴定结果表明,该菌株属于Aspergillus fumigatus这个种.对该菌株产酶特性进行了初步研究,最适产酶条件为:氮源(NH4)2SO4,接种量10%,40℃,初始pH6.0,培养60~96 h.     

烟曲霉细胞壁作为药物靶标的鉴定研究

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)作为侵袭性真菌感染的三大机会病原真菌之一,因其高致病率和高致死率而成为威胁人类健康的重大隐患。有限的抗真菌类药物以及近年来耐药性菌株的涌现使得寻找新的药物靶标并开发新型抗真菌药物迫在眉睫。真菌细胞壁作为真菌所特有的结构一直以来被认为是理想的药物靶标。本文概述了烟曲霉细胞壁结构及合成过程的相关研究进展,并分析了参与细胞壁各组分合成的酶作为药靶的可行性。     

真菌嵌合体植酸酶的构建及其抗蛋白酶水解特性研究

 在烟曲霉植酸酶（Afp）的基因上,通过PCR逐步将编码1-47、178-237及338-381多肽序列的DNA片段置换为黑曲霉NRRL 3135植酸酶（Anp）中的对应片段,构建了3个嵌合体（嵌合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因,并在毕赤酵母中将其成功表达及纯化。所有的嵌合体和亲本植酸酶均能抵抗胃蛋白酶。在m(胰蛋白酶)/m(植酸酶)为0.1时,Anp完全失活;但Afp与所有嵌合体的活性仅损失13%~23%。胰蛋白酶水解产物的SDS-PAGE结果显示嵌合体Ⅱ与Ⅲ也能被胰蛋白酶严重水解,但非变性PAGE结果却表明它们在水解后仍能保持结构完整。嵌合体也具有一些与Anp及Afp相异的新pH曲线及耐热性。实验表明,通过替换基因片段改良真菌植酸酶可行。