植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD⁺-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶. 以拟南芥生态型“Columbia gl1”及甘蓝型油菜三系“陕2A”, “陕2B”和“垦C1”的叶片为材料, 采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因. 同源性搜索发现, 来源于油菜的克隆基因是新基因. 将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点, 构建表达重组体, 均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白. 亚基0, 亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36 μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统, 体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力. 不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明, NAD-IDH由3种亚基组成, 缺一不可, 缺少亚基0是致命的, 缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的. 同时发现, 来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象, 从而发生移框突变或无义突变, 使突变亚基不表现正常亚基1功能, 导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.     

hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列；信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子(human soluble B Lymphocyte Stimulator，hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因；融合基因插入pcDNA3、pcDNA3．1、pEFneo质粒；信号肽引物设计时，突变同义密码，最终重组质粒成为分泌表达质粒；磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV-dhfr，共转染CHO-dhfr^-细胞；选择培养液筛选，氨甲喋呤扩增表达，获稳定表达rhsBLyS细胞株；ELISA检测浓缩表达上清，结果表明：rhsBLyS表达量由0．13μg/mL上升至0．55μg/mL。     

按大肠杆菌高表达序列设计的入干扰素α—2b基因的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人干扰素α—2b基因编码区的核苷酸序列，应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段，经互补片段分别退火和连接后，将完整编码区分两段分别克隆于pUC19质粒中，进行DNA序列分析，分别选取序列完全正确的两种克隆片段进行重组，获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人干扰素α—2b基因。     

水杨酸对菜豆不同器官抗氰呼吸诱导与交替氧化酶表达的比较研究

作者研究了水杨酸(SA)处理对菜豆幼苗不同器官抗氰交替途径容量(Valt)、实际运行活性(ρValt)与AOX表达量的影响。结果表明：SA未处理的菜豆幼苗不同器官中均存在抗氰呼吸，其中真叶的Valt和ρValt最高，其次是子叶，而下胚轴的最低；SA处理24h以后，均可使菜豆幼苗3种器官Valt与ρValt显著提高，但不改变三者抗氰呼吸活性的大小顺序。显然，SA对菜豆抗氰呼吸只起到诱导作用，并不改变它们不同器官间的呼吸特异性。Western杂交分析结果显示：菜豆不同器官Vah与ρValt的差异与AOX蛋白水平的变化相关，真叶中AOX的表达量最多，下胚轴的AOX表达量最少；SA处理时，诱导菜豆幼苗不同器官抗氰呼吸增高的程度与AOX合成表达量的增加一致，二者紧密相关。     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化

通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断，将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPICgK／rPA，转化Pichia pastoris GS115宿主菌．通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His^ Mut^s表型转化子．并在2．0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10，GR11．摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白分子量约39ku，能与特异性单克隆抗体发生免疫反应；体外气泡法测定rPA活性，结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性．通过正交试验，优化发酵条件，表达活性最高为1050IU／mL．     

缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导处理1、3、5d后，用酚法和TCA／丙酮法提取叶的可溶性蛋白，进行双向电泳(2-DE)分析．结果显示：(1)三种缺铁胁迫的可溶性蛋白，在不同的pH范围中2-DE图谱上的比较．使用pH3～10宽范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳分离后利用Z3图象分析软件，可在SDS-PAGE凝胶上检测到450个左右的蛋白点，酸性蛋白占89％．选用pH4～7窄范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳后可在SDS-PAGE凝胶上检测到600个左右的蛋白点，其中缺铁诱导上调表达的有29个点，减弱表达的有1个点，诱导特异表达的有5个点．(2)不同方法提取可溶性蛋白的差异．酚法提取的蛋白再溶性好，纯度较高．TCA／丙酮法简单易操作，蛋白损耗少，在2-DE图象上．碱性端显示的蛋白点较多，但此法的缺点是再溶性差，对2-DE成功分离蛋白有影响．     

D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性

以中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)SS—ori总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因，分别克隆到5种不同的载体，并转入5种不同的Escherichia coli菌株，获得25株工程菌，进行培养与诱导表达．细胞经超声处理后，通过SDS—PAGE和酶活性两种指标比较表达产物．结果表明，除3株工程菌具有D-海因酶活性外，其它均为无酶活性的不溶性包涵体，包涵体经变性、复性后，可部分获得有活性的D-海因酶，其比活为0．90U／mg，复性率约为20％．此外，对包涵体产生的原因及可能解决办法也进行了讨论．     

水稻的4个NADP-ME基因具有不同的表达模式

在高等植物中,NADP-苹果酸酶(NADP-ME)由一个小的基因家族编码.根据发表的水稻基因组序列信息,对水稻的NADP-ME家族进行了研究.结果表明:水稻NADP-ME家族由3个胞质型NADP-ME和1个质体型NADP-ME构成,发现两个新的胞质型NADP-ME基因. 尽管4个水稻NADP-ME的氨基酸序列存在较高的相似性,但是其中一个胞质型NADP-ME(OscytME3)在NADP-ME氨基酸序列保守区存在着不同于其他NADP-ME的特征. 进化树分析表明它可能起源于不同于其他NADP-ME的另一条进化分支.虽然4个NADP-ME基因表达的组织特异性和发育阶段特异性不尽相同,但是在功能上可能都参与植物的胁迫应答.