小拟南芥ApCBF基因的克隆及转化烟草的初步研究

CBF是植物冷驯化过程中的关键性调节因子。利用PCR及染色体步移法从新疆特有拟南芥近源种植物——小拟南芥的基因组中克隆了CBF基因的同源序列（DQ207404）。生物信息分析表明，该序列具有完整的读码框，推定的蛋白质序列与拟南芥CBF1，2，3的相似性分别为：87．6％、86．6％和88．1％。以植物表达载体pBI121为基础，构建了由组成型启动子35S调控ApCBF的植物表达载体pCB111。通过根癌农杆菌介导，采用叶盘法转化烟草，PCR检测初步证明却ApCBF基因已整合到烟草基因组中。为利用ApCBF基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

水稻Rho家族OsRac2启动子的转基因功能鉴定

采用PCR扩增的方法,构建了OsRac2基因转录起始位点上游1.7 kb的启动子5′缺失植物表达载体,转化烟草并筛选阳性转基因植株.以多种激素处理转基因烟草,通过组织化学分析和GUS荧光活性的检测,证实Os-Rac2启动子上存在着一些激素应答元件,该基因的表达可能受茉莉酸的正调控,脱落酸等激素的负调控.     

烟草节杆菌02181肌酸酶的纯化及理化特性

采用DEAE-纤维素和羟基磷灰石层析联合使用的纯化程序,从烟草节杆菌02181株提取纯化了肌酸酶.比活性由0.92 U/mg上升至124.44 U/mg,酶被提纯了135.26倍,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈单一区带,最终收率达52.95%.特性研究显示此酶的相对分子量为84500,等电点为4.80,在磷酸盐缓冲体系中,最适pH为6.50,pH7.00环境下耐受性最好,最适温度为35℃,米氏常数(Km)为46.50 mmol/L,最大反应速度(Vmax)为8.20 μmol/min.Cu2 、SDS可使酶完全失活,Hg2 、Cd2 、Zn2 和Fe3 明显抑制酶活性,Mg2 、Mn2 、Brij 35、Triton X-100和邻菲饶啉对酶活性有一定的抑制作用,EDTA对酶活性无明显影响,而Ca2 和NaN3对酶有一定的激活作用.络合剂邻菲饶啉和EDTA对酶活性的抑制试验表明此酶属于金属酶类.     

烟草普通花叶病的发生与药剂防治研究

对烟草普通花叶病的发生与药剂防治进行研究的结果表明 ,花叶病在 4月上旬严重发生 ,于 5月上中旬达到高峰。在选用的几种药剂中 ,病毒必克防治效果最好 ,为 5 5 .6 5 % ;其次是菌克毒克的防效为 5 0 .8% ;金叶宝的防效为 36 .1% ,植病灵的防效最差 ,仅为 0 .9%。     

胰蛋白酶抑制剂抗虫基因转化烟草的研究

实验用携带质粒pAM194/TI的根癌农杆菌LBA4404转化烟草,通过筛选,共获得35株卡那霉素抗性苗.GUS组织染色、PCR检测及抗虫试验表明胰蛋白酶抑制剂抗虫基因已经成功地整合进再生植株染色体基因组中,有些已正确表达.     

烟草花药发育过程中钙动态分布的初步观察

在烟草花药发育过程中,用焦锑酸钾沉淀的松弛结合钙显示出了一个与花药发育事态有关的动态:在孢原细胞时期的花药中几乎看不到钙颗粒.但到小孢子母细胞时期,花药中开始有钙颗粒沉淀,而且显示出向花药室中流动的迹象.当花粉母细胞进行减数分裂时,花药绒毡层细胞和花粉母细胞中出现了许多的细小钙颗粒.在小孢子发育时期,在绒毡层细胞解体之前,细胞中的钙被集中到小液泡中.在小孢子细胞质中仍有较多的钙颗粒,同时在花粉壁上也有钙颗粒沉积在外壁的基部.到小孢子分裂形成二胞花粉后,细胞质中的钙明显减少.当二胞花粉中的大液泡消失,细胞质中积累淀粉粒以后,花粉中可看到的钙颗粒很少.同时,在花药维管束周围的薄壁细胞中,又出现了较多的钙颗粒,表明花粉对钙离子的需求可能已降低.烟草花药发育过程中钙的动态分布特征暗示着钙参与了调控花粉发育过程,尤其是与小孢子转变过程中的重要事态有密切关系.     

苜蓿花叶病毒RNA23''''端cDNA转基因烟草的研究

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV—Ch)RNA23′端cDNA重组到植物表达载体pROKⅡ中，用三亲融合法导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，采用叶圆片法转化普通烟草，诱导再生小植株．经卡那霉素抗性筛选和PCR检测，证明AIMV RNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．     

红树植物耐盐基因转化烟草及耐盐品系的培育

从耐盐性强的红树植物白骨壤(Avicennia marina)中分离出的耐盐基因CSRG1, 构建了pGAM189/CSRG1转基因载体. 以烟草嫩叶为外植体, 通过农杆菌介导的叶盘转化法将CSRG1基因及GUS基因, Km^r基因和Hyg^r基因转入烟草基因组中. 转化50个外植体, 经过50 mg/L潮霉素和150 mg/L卡那霉素抗性筛选共获得了13个稳定抗性株系. 通过PCR扩增检测、Southern blot分析和GUS基因活性检测, 结果表明, 最终获得的11个转基因品系(基因转化频率为22%)中, CSRG1基因整合到烟草的染色体DNA上. Northern blot分析结果表明, CSRG1基因在转基因植株中获得表达. 耐盐性测定和光合速率测定结果表明, 转基因植株在盐分提高到2% NaCl和全海水(盐度为24)配置的MS培养基中, 成活率保持在80%~90%, 株高增长20%~40%, CSRG1基因的表达产物及形成的生理代谢途径确实可使烟草获得较高的耐盐性, 同时这种耐盐性不仅针对钠离子胁迫, 而且对于各种离子的综合盐胁迫都具有耐受性.     

转几丁质酶基因烟草后代的遗传分析

本论文采用分子检测(PCR扩增、PCR-Southern杂交)与表型检测(接真菌实验、酶活力测定)相结合的手段，对花粉管通道法及载体法导入几丁质酶基因烟草后代的遗传表现进行研究。结果证明通过不同方法导入受体细胞基因组中的外源基因均能遗传给后代，并能在转化受体当代及后代中高效表达。但采用花粉管通道法导入的外源基因虽然能够遗传给后代，但分离比复杂，遗传规律性较差。而载体法导入的外源基因T1代x^2检测符合3：1的遗传分离比，遗传稳定性要好于DNA直接导入。因此，建立良好的遗传转化系统是外源基因稳定遗传和表达的前提。     

一个特殊的顺式发夹核酶对感染烟草原生质体的影响

研究一个烟草花叶病毒(TMV)cDNA3′末端被特异切割的发夹核酶对感染原生质体的作用。选用一个外源基因绿色水母荧光蛋白(GFPuv)作为报道基因，取代了大部分的CP编码区域，以研究在烟草原生质体中发夹核酶对TMV载体的复制，通过GFP的表达来确定表达量。顺式发夹核酶对TMV载体感染效率的影响通过体外转录来观察。TMV GFPRIB体外转录感染原生质体的效率比与其不含该核酶的对应物的感染效率高3～5倍。Northern杂交结果表明，包括核酶在内的3’末端非病毒序列在体外转录反应开始后就被顺式发夹核酶切除了。当直接用载体DNA pSTMVGFPRIB感染原生质体时，感染原生质体的数量比与之相对应的pSTMVGFP NOS感染原生质体数多50％～80％。