中华猕猴桃蛋白酶热失活动力学

改进了酶的提纯方法获得聚焦电泳为单一区带酶制剂。酶热失活以 HbCO 为底物时为一级反应,动力学方法表明 HbCO 对酶的热失活有保护作用,68.90℃时k_(+0)/k′_(+3)比值24,“HbCO”络合物活化能 535kJ/mol,焓 531 kJ/mol,自由能 116kJ/mol,熵1 212kJ/mol,生成自由能和生成热分别为20和209kJ/mol,这些参数说明 HbCO对酶热失活保护作用以及对酶构象影响可能与二者的多键结合和HbCO 水化作用有关。本文中还得到CBZ-Lys-ONp 为底物的热力学参数,观察到 DTT 对酶热失活保护是很小的。     

鲨鱼肠道蛋白酶的分离纯化及性质的初步研究

以鲨鱼肠为材料，经柠檬酸缓冲液抽提，硫酸铵分级分离，ＣＭ－纤维素离子交换柱层析纯化，获得蛋白酶（Ⅰ）和蛋白酶（Ⅱ），研究了蛋白酶Ⅱ性质，酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一蛋白纯，酶的紫外吸收特征峰在２７５ｎｍ处，测得酶的分子量为１８ｋｄ，在ＰＨ８．０、３７℃下酶催化酪蛋白水解的Ｋｍ值为６．９×１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ。酶水解酪蛋白的最活温度为５２℃，活化能为７６．５３ｋＪ／ｍｏｌ。几种金属离子对酶活力的     

竹红菌乙素对肌质网Ca~(2+)-ATP酶蛋白色氨酸荧光猝灭研究

肌质网Ca~(2+)-ATP酶是一种重要的膜蛋白酶,它在肌细胞的收缩舒张功能中起重要作用,因而其动力学行为被广泛地研究,但是有关结构与功能之间关系的直接实验数据仍然不足.为了从分子水平上阐明Ca~(2+)-ATP酶催化原理,1993年Ferrira用荧光猝灭方法首先观察了肌质网Ca~(2+)-ATP酶在加入Ca~(2+)前后分子构象的变化.由于作者使用的猝灭剂是分子氧,除了在测定工作中使用不方便之外,灵敏度也不够高.为此本文用竹红菌乙素作为肌质网Ca~(2+)-ATP酶荧光猝灭剂,分别测定了该酶在有钙或无钙的条件下荧光猝灭的情况,结果证明竹红菌乙素可以在稳态和瞬态的条件下观察到体系中有钙或无钙时的荧光猝灭常数变化的情况(即不同的K_q值);进而说明了竹红菌乙素作为肌质网蛋白荧光猝灭剂可以得到比氧更多的信息和许多其他优点.     

丝兰酶及其提取工艺的研究

直接干燥丝兰叶表栅状组织获得粗酶。用硫酸铵分级盐析取得酶制剂，它的最适ｐＨ值为１２。用有机汞作配基的琼脂糖凝胶４Ｂ柱分离出酶，聚丙烯酸胺凝胶电泳证明柱分离物为两个蛋白酶组分（ＹｕｃｃａｉｎⅠ、Ｙｕｃ－ｃａｉｎⅡ），簿层等电聚焦电泳证实这两个组分等电点分别为ｐＨ值９．７７和ｐＨ值９．６１，ＳＤＳ电泳两个酶仅看到１条染色带，测得分子量为３万。它们的活性均依赖于巯基。     

Overinhibition of Mitogen-Activated Protein Kinase Inducing Tau Hyperphosphorylation

To reveal the relationship between mitogen-activated protein kinase (MAPK) and tau phosphorylation, we used different concentration of PD98059, an inhibitor of MEK (MAPK kinase), to treat mice neuroblastma (N2a) cell line for 6 h. It showed that the activity of MAPK decreased in a dose-dependent manner. But Western blot and immunofluorescence revealed that just when the cells were treated with 16μmol/L PD98059, tau was hyperphosphorylated at Ser396/404 and Ser199/202 sites. We obtained the conclusion that overinhibited MAPK induced tau hyperphosphorylation at Ser396/404 and Ser199/202 sites.     

基质金属蛋白酶-28在人细胞滋养层细胞与绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞中的表达

细胞滋养层细胞和肿瘤细胞的侵入行为具有惊人的相似性，其中基质金属蛋白酶（MMPs）是滋养层细胞和肿瘤细胞侵入的非常重要的介导因素。近来，MMPs家族的一个新成员－MMP－28被克隆并确定下来，采用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）、酶谱分析和Northern blot等方法，检测了妊娠早期细胞滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系JEG－3细胞中MMP－28的基因表达和蛋白分泌情况。RT－PCR显示，细胞滋养层细胞JEG－3细胞均有MMP－28mRNA的表达；Northern blot研究显示，JEG－3细胞中MMP-28mRNA的表达强于细胞滋养层细胞中MMP－28mRNA的表达，具有时间依赖关系；酶谱分析显示，JEG－3细胞中MMP－228蛋白分泌 活性高于细胞滋养层细胞中MMP－28蛋白分泌活性，呈时间依赖关系，这与MMP－28的基因表达结果相一致。进一步证明了MMP－28可能在正常妊娠和肿瘤发展等一些与组织重建有关的过程中发挥一定的作用。     

胰岛素口服给药

注射是胰岛素目前临床应用的惟一给药途径，但由于半衰期短，需长期频繁注射，造成患者身体、心理和经济上的极大负担，口服胰岛素的最大优势在于减少与副作用相关的注射次数，增加病人的治疗依从性，从长远上降低糖尿病相关的发病率和死亡率，由于口服方便、安全且最符合内生胰岛素分泌模式，研发胰岛素口服剂型是目前国际胰岛素药物的发展前沿，研究集中在分子修饰、使用酶抑制剂和吸收促进剂，微粒等方面，其中，用生物降解高分子材料制备包封率、载药率和制剂稳定性较高的胰岛素毫微粒正成为主流方向，是最有希望的胰岛素口服制剂制备途径，口服剂型的研制成功、将是胰岛素非注射剂型研究的革命性突破，并会产生巨大的理论和商业价值。     

基质金属蛋白酶-26(MMP-26)在小鼠胚胎植入过程中的作用

基质金属蛋白酶-26（MMP-26，又称Endometase或基质水解素-2）是MMPs家族的一个新成员，它可在胎盘，子宫以及不同肿瘤细胞系中表达，采用子宫角注射，免疫组化，原位杂交，胚泡与子宫上皮单层培养，免疫印迹，RT-PCR和RNA印迹等多种体内外实验方法研究并报道了MMP-26在小鼠胚胎中的表达以及MMP-26抗体在胚胎植入中的作用，研究表明，MMP-26的mRNA与蛋白在小鼠胚泡中均有强烈的表达，此外，体内研究显示，MMP-26抗体能显著抑制小鼠胚胎的着床；在体外培养体系中，MMP-26抗体可显著抑制小鼠胚泡在子宫上皮单层上的黏附与扩展；同时，MMP-26抗体以剂量依赖关系抑制整合素αV亚基mRNA和蛋白的表达，研究提示，MMP-26可能直接或间接参与滋养层细胞侵入子宫内膜的过程，促使小鼠胚泡成功植入。     

转番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因烟草植株的培育及其抗虫特性分析

将分离的番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因cDNA序列tin2和含有一个109bp内含子的基因组DNA序列tin2i,分别构建成植物表达载体pBCT2和pBT2.然后通过农杆菌介导转化烟草叶片外植体,获得了两类转基因烟草植株.分子生物学检测和胰蛋白酶抑制剂活性分析结果表明,tin2序列和tin2i序列都能够在转基因烟草中正确表达.抗虫活性检测结果显示,转tin2i序列的烟草植株的抗虫活性高于转tin2序列的烟草植株,推测这可能与tin2i序列中内含子的存在有关.     

生物技术在水产食品加工上之应用--利用生物技术生产鱼肉蛋白降解抑制剂

鲭鱼 (Scomberaustralasicus)、鳕鱼 (Merlucciusproductus)、鲑鱼 (Oncorhynchusketa)、大西洋产鳕鱼或比目鱼等鱼浆在冷冻贮藏过程中极易因CathepsinsB、H、I等之残存而造成品质下降 ,而且于制造鱼浆加工品时 ,常会在加热过程发生鱼浆解胶 (thermaldegradation)之品质劣变问题 .由过去之研究结果显示 ,CathepsinB、L等硫氢蛋白酶均会影响鱼浆蛋白的冷冻安定性及热凝胶特性 .由于从农、畜、水产原料中分离与制备蛋白酶抑制剂极不经济 ,且产量也受限 ,因此 ,本研究室将鸡肺的cystatincDNA序列利用pET - 2 3a(+)表现载体表现 ,并转送到大肠杆菌AD4 94 (DE3)pLysS细胞内 ,经由isopropyl- β -D -thiogalactopyranoside(IPTG)诱导 ,可在大肠杆菌细胞质内表现出高量具有正确蛋白分子内双硫键及活性之recombinantcystatin .基于安全及工业上量产之考量 ,本研究室亦将此cystatin的cDNA序列 ,接到PGAPZαC表现载体上并将此载体转送入酵母菌PichiapastorisX - 33细胞中 ,令cystatincDNA整合到此酵母菌核内之染色体DNA上 ,经由此载体上之GAPpromoter的调控及α -factorprepros equence之引导可以于培养液中大量的表现出具有正确蛋白结构及活性之胞外分泌型recombinantcystatin .以上两蛋白质均经由分离纯化及生化