鱼腥藻PCC7120染色体基因对asr0757/alr0758的表达优化及其鉴定

NCBI预测鱼腥藻PCC7120染色体上的基因对asr0757/alr0758可能构成一个毒素-抗毒素系统.为研究其是否属于毒素-抗毒素系统家族,分别构建这两个基因的表达载体.用1.0 mM IPTG诱导重组菌表达,优化表达条件,并对表达出的蛋白进行纯化与western blot检测.SDS-PAGE结果显示：asr0757与alr0758在37℃下诱导6 h后,均成功诱导表达出目的蛋白asr0757(13.5 KD)和alr0758(17.9 KD).抗毒素表达量较好,毒素alr0758表达量较少.通过设置诱导时间梯度和IPTG浓度梯度优化毒素基因表达条件,优化结果显示：毒素基因alr0758在28℃,IPTG浓度为0.4 mM,诱导10 h时有最大表达量.蛋白纯化与western blot结果证实诱导表达的蛋白为目的蛋白.     

金黄色葡萄球菌GST-mTSST-1的免疫活性检测方法的研究

通过对影响琼脂扩散反应的多种条件进行优化,建立了检测金黄色葡萄球菌无毒诱变中毒性休克综合征毒素1融合蛋白GST-mTSST-1免疫活性的双向免疫琼脂扩散检测方法．检测的灵敏度可达到120ng／mL．此方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点,对具有免疫活性的抗原蛋白的定量检测有一定的参考价值．     

除虫菊酯人工抗原的合成及鉴定

通过在除虫菊酯6种单体的五元环酮基上引入羧基的方法制备半抗原,再用碳二亚胺法偶联到牛血清白蛋白(BSA)上制得完全抗原.经紫外光谱测定,6种完全抗原的分子偶联比为6:1(除虫菊酯Ⅰ:BSA)、13:1(除虫菊酯Ⅱ:BSA)、9:1(瓜叶菊酯Ⅰ:BSA)、11:1(瓜叶菊酯Ⅱ:BSA)、7:1(茉酮菊酯Ⅰ:BSA)和9:1(茉酮菊酯Ⅱ:BSA).以完全抗原免疫BALB/c小鼠制抗血清,采用间接酶联检测抗体效价均达到105以上,再用饱和硫酸铵沉淀得到除虫菊酯的多克隆抗体.该结果为除虫菊酯的酶联抗体检测及免疫分析技术奠定了基础.     

DAB389-Linker-LHRH重组毒素的构建及生物活性的初步测定

采用基因工程方法,将白喉毒素的毒性部分(DAB389)通过柔性连接肽(Linker)与促黄体激素释放素(LHRH)基因连接起来,克隆到高效表达载体pET28a( )中,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白(DAB389-Linker-LHRH).通过三步层析纯化目的蛋白,获得了纯度达95%的重组毒素DAB389-Linker-LHRH.用MTT法检测其对过度表达LHRH受体的人宫颈癌HeLa细胞的毒性作用,探讨其对HeLa细胞的特异杀伤情况.实验结果显示DAB389-Linker-LHRH对HeLa细胞具有很强的生长抑制作用,其IC50为12.93μg/mL.表明该免疫重组毒素在体外对人宫颈癌HeLa细胞具有明显的杀伤作用,为进一步研制对宫颈癌有特异治疗作用的靶向抗癌药物奠定了基础.     

黄曲霉毒素B_1人工抗原的制备、鉴定与免疫特性研究

采用EDC法制备获得黄曲霉毒素B1人工抗原AFB1-BSA。对AFB1-BSA紫外扫描,结果表明其图谱与黄曲霉毒素B1和BSA的图谱有明显差异,其红外扫描结果与BSA的图谱也有明显差异,表明BSA与黄曲霉毒素B1偶联成功。以不同摩尔比的AFB1-BSA人工抗原免疫小鼠,制备了特异性的鼠抗AFB1多克隆抗血清。综合评价不同起始摩尔比反应所得人工抗原的免疫特性和AFB1转化率,当AFB1与BSA的起始摩尔比为40∶1时,AFB1与BSA的偶联产物摩尔比为4.93∶1,AFB1的转化率达12.33%;用间接ELISA法测其抗血清的效价,经过四次免疫之后,抗血清的效价最高,高达1∶1 056 000。     

牛奶中三聚氰胺残留胶体金免疫层析快速检测方法研究

为建立牛奶中三聚氰胺免疫层析快速检测方法,采用胶体金偶联特异性三聚氰胺抗体,优化试纸条T线抗原包被量、金标抗体用量、二抗稀释倍数等条件,构建三聚氰胺免疫层析试纸条.结果表明,T线抗原包被量为0. 25μg/mL,金标抗体用量为9. 0μL/条,二抗稀释倍数为1:100时效果最佳;最优条件下该试纸条的最低检出限为0. 25μg/mL,结果可在5 min内进行判读,且牛奶样品不需任何处理可直接进行测定.本研究建立的免疫检测方法适用于牛奶中三聚氰胺的检测.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

3,5-二硝基水杨酸法测定液体糖中总糖含量

建立3,5-二硝基水杨酸(DNS)测定液体糖中总糖的检测方法,并对总糖的水解条件和还原糖的检测条件进行了优化.结果表明,液体糖中总糖的水解条件为:糖液样品与2 mol/L盐酸体积比为1∶0.5,50℃水浴加热5 min;还原糖的检测条件为:测定波长500 nm,显色剂DNS用量1.5 mL,沸水浴加热7 min,显色时间30 min.标准品葡萄糖在0.1～1.4 mg/mL范围内呈良好的线性关系,平均加标回收率为99.56%,RSD值为3.16%,相关系数R~2=0.999.精密度、重复性和稳定性试验结果的相对标准偏差均小于3%,表明该方法可用于液体糖中总糖含量的测定.     

镍催化卤代烷烃交叉偶联反应的配体忧化

两个结构相似的卤代烷烃直接经过镍催化还原偶联反应生成新的 C(sp³ )—C(sp³ ) 键 一直是有机合成中的难点. 通过前期的研究发现, 采用 Zn 作还原剂, Ni(cod)₂ 作催化剂, 在 Pybox 类配体存在的条件下, 可以成功地实现不同卤代烷烃的交联反应, 不过其中一个卤代烷烃必须使用 3 mol 的用量. 为了进一步提高反应的效率, 采用 2 mol 的 1-溴丁烷和 1 mol 的 4-溴-1-对甲苯磺酰基哌啶为模型进行反应, 通过优化反应条件, 特别是对配体结构的修饰, 进一步提高不活泼烷基卤代物的还原交叉偶联反应效率. 研究结果表明, Pybox 类配体是效果较好的配体, 而二齿配体在吡啶存在的条件下也能得到中等期望值的产率. 这一结果为今后进一步优化反应提供了参考依据.     

铜金属配合物和质子酸在可见光下催化喹啉与异喹啉的偶联反应

为了优化喹啉和异喹啉化合物的偶联反应,降低反应成本,以可见光为能源,2,9-二甲基-4,7-二苯基-1,10-邻菲啰啉碳硼烷双二苯基膦一价铜配合物(Cu1)和质子酸为双催化剂,引发2-甲基喹啉和N-苯基四氢异喹啉的偶联反应.最佳反应条件为:催化剂Cu1的用量为3.0μmol,质子酸的种类为间甲基苯甲酸,其用量为6.0μmol,溶剂为甲醇与乙腈的等体积混合物(各1.0 mL),反应时间为35 h.在此条件下,选用分别带有不同取代基的2-甲基喹啉和四氢异喹啉为反应底物,成功合成了15种化合物,产率为27%~91%.结果表明,在Cu1和质子酸的催化下,可见光可以成功引发喹啉和异喹啉的偶联反应.     

柠檬黄的ELISA检测方法的建立

利用免疫学基本原理，获取抗柠檬黄的单克隆抗体，以此建立了从食品中检测柠檬黄的间接竞争ELISA．试验表明：OVA—TE最适包被浓度为1μg／mL；酶标抗体最适工作浓度为1：3000；酶标抗体的作用温度和时间分别为37℃，lh；封闭液为1％明胶；底物显色时间为15min；对柠檬黄的最低检出量为26．34ng／mL；抗体的最适稀释倍数为1：12000倍；对该方法进行交叉性试验和重复性试验，结果表明此法是一种特异、灵敏、快速的检测方法，并适合大批量样品检测．     

Determination of Cd-MT in <Emphasis Type="Italic">Pteria penguin</Emphasis> with indirect non-competitive ELISA

Cadmium-metallothionein (Cd-MT) of Pteria penguin was used to immunize domestic rabbit in order to obtain polyclonal antibody against Cd-MT. Using the anti-Cd-MT antibody, a method of indirect non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay (non-competitive ELISA) was established to detect shellfish Cd-MT. In this case, the minimum detectable concentration of P. penguin Cd-MT was (4.563±0.051) ng/mL. The linear range of detection was 9.75-2.0×104 ng/mL. Intra-assay relative standard deviation (RSD) was less than 11.6%, and inter-assay RSD less than 6.7%. The recovery rates ranged from 83.7% to 119.0%. The polyclonal antibody against Cd-MT of P. penguin can also be used to detect MT of other four types of shellfish. In the crude extracts from different organs of P. penguin, the MT concentrations determined by this method matched well with the concentrations of cadmium detected by the atomic absorption spectroscopy.     

降低酶联核酸适配体分析方法中非特异性吸附的分析研究

以检测蜂蜜中的四环素残留为例，构建间接竞争酶联核酸适体分析法（ic-ELAA），就ic-ELAA中非特异性吸附的影响因素进行分析，探讨降低非特异性吸附的措施。结果表明：选择2 μg/mL四环素-牛血清蛋白在10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）中过夜包被，次日用0.5 g/mL酪蛋白封闭1 h，竞争反应后用6 μg/mL链霉亲和素-辣根过氧化物酶催化颜色反应放大竞争效果，最后采用450 nm和630 nm双波长读数，可得到灵敏度为0.035 ng/mL的竞争曲线。同时，根据长期实验经验，提出其他降低非特异性吸附的注意事项。     

不同小鼠肝炎病毒对ELISA方法检测其血清抗体的影响

目的 建立小鼠肝炎病毒（Mouse Hepatitis Virus,MHV）血清抗体ELISA检测方法,用于本地区MHV的日常监测,以便对SPF小鼠感染状况及时作出判断。方法 选取3种MHV毒株MHV1、MHV-JHM和MHV-A59,通过L929细胞扩增培养获得纯化浓缩抗原并筛选适合包被抗原类型;免疫BALB/C小鼠,获得高效价免疫阳性血清;优化ELISA反应体系建立规范化的ELISA试剂盒并用于临床小鼠血清样品的检测。结果 筛选出适合本地区的MHV包被抗原类型为MHV1,建立了病毒扩增及浓缩纯化方法,制备的MHV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为标准化质控血清。包被抗原、待检血清和酶结合物最佳工作浓度分别为4. 0μg/m L (10 -7. 73 /0. 1 m L TCID50)、1∶40和1∶4 000稀释;批次内和批次间平均变异系数分别为5. 13%和5. 57%;检测灵敏度为1∶4 000稀释;与小鼠仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼肠孤病毒III型（Reo3）、小鼠细小病毒（MVM）和鼠痘病毒（Ect）阳性血清均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于10%。对165份血清样品进行检测,阳性血清相符率97. 37%（37/38）,阴性血清相符率92. 19%（118/127）。结论 本研究建立的ELISA方法检测小鼠血清MHV抗体具有较高的特异性、敏感性和结果可重复性,可以用于本地区MHV日常病原学监测,以便对小鼠感染状况作出准确判断。     

抗丁草胺多克隆抗体的制备及应用

以牛血清白蛋白-丁草胺免疫抗原免疫家兔获得了抗丁草胺多克隆抗体,并建立了竞争酶联免疫吸附检测丁草胺(除草剂中的一种主要成分)分析方法。该方法的检测范围在1×10^-9～100×10^-9mg/mL之间,且和化学结构相似的甲草胺和乙草胺无交叉反应。该方法也可用于检测稻田水样中丁草胺的含量。     

黄曲霉素M1间接竞争ELISA的建立及其在牛奶中的应用

利用高特异性单克隆抗体,建立黄曲霉素M1的间接竞争ELISA检测方法。棋盘法优化了包被抗原及酶标抗体的最佳稀释倍数。包被抗原和酶标抗体的最佳工作浓度分别为1∶15000和1∶2000。该方法的线性范围为(0.1—8.1)ng·mL-1。除了与黄曲霉素B1的交叉反应为35%外,与黄曲霉素B2、黄曲霉素G1及黄曲霉素G2的交叉反应均小于1%。在牛奶实际样品检测的回收率均大于70%,而且检测过程在10min以内即可完成。该方法灵敏度高,特异性强,而且操作简单,适合多样本的快速筛查,为黄曲霉素M1的高效检测提供了一个良好的选择。     

Determination of the total concentration of casein and β-lactoglobulin by indirect competitive ELISA in milk and dairy products

The main purpose of this work was to develop an assay as a means of quality control in milk and dairy products. As specific and high abundant proteins in milk and diary products, casein and β-lactoglobulin were chosen as the targets, and an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was developed for determination of the total concentration of casein and β-lactoglobulin. The detection limit of the assay was 79.07 ng/mL, and a working range of the calibration curve was from 140.6 to 36,000 ng/mL. The intrassay and inter-assay coefficients of variations were 4.7 % and 6.5 %, respectively. The recoveries ranged from 94.1% to 106.6 %. The developed ELISA assay was used to detect the total con- centration of casein and β-lactoglobulin in liquid milk and milk powder. The results indicated that the developed assay was very specific, and the addition of nonprotein nitrogen （such as melamine, cyanuric acid, and urea） and vegetable protein did not affect the detection. The good performance of the assay makes it suitable for use in the quality control of milk and dairy products.     

贝类产品中软骨藻酸的HPLC检测方法

建立了高效液相色谱测定贝类产品中软骨藻酸的检测方法,具体过程为:样品先经甲醇浸提后,再用甲醇-水(V（甲醇）∶V（水）=1∶1）提取2次,合并提取液后用Zorbax SB300-C18柱(2.1 mm×250 mm,5 μm)进行分离,以乙腈-0.2%磷酸水溶液（含0.1%三乙胺）（V（乙腈）∶V（磷酸水溶液）=12∶88）为流动相于室温下等度洗脱,流速为0.25 mL/min,进样量20 μL,检测波长为242 nm.结果表明,在建立的提取方法和色谱条件下,软骨藻酸从复杂的样品基体中被分离出来,在0.02~1.0 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系（r＞0.999）,样品的平均加标回收率为108%,测量方法的RSD为3.5%（n=6）,检出限为23.5 ng/g.所建立的检测方法可适用于对贝类产品中软骨藻酸的快速检测.     

节球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前处理方法研究

采用固相萃取前处理技术和酶联免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays,ELISAs)检测技术,研究了水样中节球藻和柱胞藻毒素的免疫前处理方法.由于两种藻毒素极性差异较大,分别对水样中节球藻和柱胞藻毒素采用不同的前处理方法,具体如下.①节球藻毒素:先后用10 mL甲醇和10 mL纯水...     

氟苯尼考残留的酶联免疫检测方法的研究

对氟苯尼考进行结构改造制备半抗原及抗原,免疫家兔得到多克隆抗体。经测定,该抗体对氟苯尼考和氟苯尼考胺均有反应,且灵敏度较高,效价达到1∶480 000;在此基础上通过对各实验条件参数的优化建立了间接竞争酶联免疫检测方法,该方法检测限为0.5μg/kg,以20,50μg/kg进行空白样品添加实验,回收率为82.5%～96.0%,批间变异系数在4.1%～15.2%,可初步用于动物组织样本中氟苯尼考残留的检测.