牛亚科3个主要家养牛种MyoG基因多态性及其遗传分化

对普通牛(鲁西牛、渤海黑牛)、天祝牦牛和中国广西水牛的MyoG基因部分核苷酸序列变异进行了分析,旨在揭示不同牛种群的DNA多态性及其遗传分化.采用PCR和DNA直接测序技术获得4个牛群体的MyoG基因exon 1和5’侧翼部分序列,与GenBanK公布的牛亚科动物同源序列作比对分析.结果显示,在渤海黑牛和牦牛未发现多态位点;鲁西牛存在1个多态位点,定义了2个单倍型;水牛有6个突变位点,但群内只发现1个多态位点.核苷核苷酸多样性(Pi)在0.000 00～0.001 35之间,说明群体内遗传多态性程度较低。核苷酸歧义度(Dxy)以水牛与鲁西牛之间比较最高,为0.013 97,表明水牛遗传分化明显.种系进化树分析表明,牦牛与普通牛亲缘关系很近,二者与水牛关系较远,支持将牦牛归为牛属(Bos)的一个亚属或一个种的观点.     

中国部分地方牛种mtDNA D-loop区全序列的遗传多样性与系统进化分析

利用PCR测序及生物信息学分析技术,对我国5个地方黄牛品种、5个地方水牛品种及2个地方牦牛品种的mtDNA D-loop区全序列进行PCR扩增以及核苷酸多样度、单倍型多样度分析,发现中国地方黄牛、水牛与牦牛具有丰富的遗传多样性.对试验牛mtDNA D-loop区全序列与牛亚科代表性物种黄牛、水牛、家牦牛、野牦牛、欧洲普通牛、印度瘤牛以及摩拉水牛相应序列进行系统发育分析.结果显示:黄牛与牦牛的亲缘关系较近,它们与水牛的亲缘关系较远;中国水牛属于沼泽型水牛,也有少量江河型水牛渐渗入中国水牛群体;中国黄牛为普通牛和瘤牛的混合母系起源;进化树显示高原牦牛与野牦牛的亲缘关系较近,环湖牦牛与家牦牛的亲缘关系较近.     

昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段多态性的快速检测

分析昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段多态性.用Chelex-100方法从昌台牦牛(n=100)全乳中提取基因组DNA,利用PCR对κ-酪蛋白基因第四外显子部分片段进行扩增,通过非变性PAGE及银染确定κ-酪蛋白基因重复片段多态性.结果显示昌台牦牛κ-酪蛋白基因重复片段存在A和B两种等位基因,基因频率分别为0.094,0.906,B等位基因包含12 bp的重复片段.AB型个体17个,BB型个体73个.昌台牦牛κ-CN基因重复片段等位基因B为优势等位基因.     

牦牛和犏牛睾丸SAMD12基因的克隆测序及其mRNA水平比较

SAMD12是新近发现的SAM结构域家族成员.为进一步探究犏牛雄性不育的分子机制,实验从健康成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸组织中提取总RNA,利用常规基因克隆技术,对牦牛SAMD12基因进行克隆测序,并采用实时荧光定量PCR技术,比较牦牛和犏牛睾丸中SAMD12基因mRNA水平.结果本实验克隆获得了牦牛SAMD12基因的3种变异体,分别命名为v715、v779和v852.v715与普通牛5号变异体完全对应;v779含SAM结构域但与普通牛序列存在一些差异,可能是SAMD12基因的新变异体类型;v852无结构域部分可能不表现活性.定量PCR结果显示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但表达量差异不显著,推测其表达水平与犏牛雄性不育无直接关系.     

牦牛α-乳清蛋白基因5''''-非翻译区部分序列测定及PCR-RFLP分析

用PCR方法扩增了麦洼牦牛α-乳清蛋白基因5'-非翻译区的部分序列.该序列与普通牛的相应序列具有很高的同源性(98.1%),但存在8个碱基差异,碱基突变类型包括1个缺失,5个转换和2个颠换.应用PCR-RFLP方法分析了麦洼牦牛和九龙牦牛α-乳清蛋白基因-1689位单碱基的多态性,结果在该位点没有检测到多态性.     

牦牛α-乳清蛋白基因5′-非翻译区部分序列测定及PCR-RFLP分析

用PCR方法扩增了麦洼牦牛α-乳清蛋白基因5′-非翻译区的部分序列.该序列与普通牛的相应序列具有很高的同源性(98.1℅),但存在8个碱基差异,碱基突变类型包括1个缺失,5个转换和2个颠换.应用PCR-RFLP方法分析了麦洼牦牛和九龙牦牛α-乳清蛋白基因-1689位单碱基的多态性,结果在该位点没有检测到多态性.     

牦牛DIO2基因克隆及其在骨骼肌的表达分析

为探索DIO2基因调控牦牛骨骼肌发育及肌纤维类型组成的潜在功能,克隆DIO2基因CDS序列并进行相关的生物信息学分析,以及比较分析其在牦牛骨骼肌的差异表达.结果显示,DIO2基因的CDS全长为789 bp,编码132个氨基酸.序列同源性比对及系统进化树分析发现,牦牛DIO2基因与普通牛的亲缘关系最近,核酸及蛋白序列与普通牛一致;与小鼠的亲缘关系较远,序列同源性仅为86.75%和87.12%,与原鸡的亲缘关系最远,二者的同源性分别为79.17%和76.30%.理化性质预测表明DIO2蛋白为不稳定疏水性蛋白,有跨膜结构域,具有24个磷酸化位点,蛋白结构为无规则卷曲、α-螺旋和延伸链三者交替出现.采用实时荧光定量PCR分析显示,DIO2基因在牦牛的脾、肺等内脏组织表达无显著差异;在背最长肌和半腱肌的表达量显著高于脂肪和肝脏组织(P0.01).此外,DIO2在金川牦牛半腱肌的表达量显著高于麦洼牦牛(P0.05).以上结果为研究DIO2在牦牛骨骼肌的功能提供参考资料.     

牦牛SRY和TRO基因部分序列克隆与测序分析

对牦牛SRY和TRO的部分基因克隆和序列分析,以期为牦牛X精子和Y精子鉴定、性染色体的基因定位以及分子标记辅助选择研究提供理论依据.从牦牛和西门塔尔牛冷冻精液中提取DNA,用特定引物对SRY、TRO基因部分序列进行扩增并进行TA克隆和测序.结果表明,这两个基因区域在牛种中有极高的保守性,牦牛与普通牛SRY和TRO基因这两个区域的核酸同源性分别高达99.08%和99.39%.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

牦牛乳上皮粘蛋白MUC1的遗传多态性研究

采用凝胶电泳方法分离牦牛乳上皮粘蛋白MUC1，通过比较乳MUC1的多态性发现麦洼牦牛、九龙牦牛、天祝白牦牛、青海牦牛和西藏牦牛共5个牦牛群427头泌乳牦牛乳MUC1存在9种MUC1类型，蛋白质分子质量范围为163—208ku，普遍大于普通乳牛；群体遗传变异分析表明牦牛乳MUC1的基因频率、基因型频率存在品种间差异，基因杂合度较大，根据乳MUC1基因频率可将5个牦牛品种明显地聚为两类，提示牦牛乳MUC1存在地方类群的特异性.     

牦牛和黄牛睾丸组织Prdm9基因cDNA序列的比较

为比较牦牛与普通牛Prdm9基因的序列特征,采用RT-PCR和3’-RACE方法,从牦牛和黄牛睾丸组织总RNA中分别获得Prdm9基因的部分cDNA序列,经过拼接后获得了牦牛和黄牛Prdm9基因的完整cDNA序列,长度分别为2580bp和2421bp,编码序列长度均为2091bp,共编码696个氨基酸,氨基酸序列相似性为98.56%.分析显示,牦牛和黄牛Prdm9基因开放阅读框有10个核苷酸同义突变和10个单核苷酸多态性(SNPs),并导致10个氨基酸差异,其中4个位于锌指域.研究结果表明,牦牛和黄牛Prdm9基因结构特征类似,但在锌指域存在一些氨基酸差异,可能会影响该基因的功能.     

牦牛GPRIN3基因的克隆及组织表达分析

为探索GPRIN3基因的生物学特性,以麦洼牦牛为试验材料,利用RT-PCR技术扩增GPRIN3基因编码区序列并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测GPRIN3在牦牛不同组织的mRNA表达水平.结果表明,克隆得到GPRIN3基因编码区序列大小为2 343 bp,编码780个氨基酸残基;麦洼牦牛与野牦牛氨基酸序列相比,一致性为99.62%,共有3个位点发生突变,分别是103(G→R)、366(T→M)、404(E→K).系统进化分析显示,牦牛与野牦牛亲缘关系最近,其次是普通牛,与黑猩猩的亲缘关系最远;含有GRIN-C超家族保守功能结构域;实时荧光定量PCR结果表明,GPRIN3在麦洼牦牛肺脏组织中表达量最高,其次是肝脏,在臀肌中表达量最低.本研究为进一步探讨牦牛GPRIN3基因及其编码蛋白的结构和功能提供理论基础,为牦牛分子育种提供新思路.     

牦牛黑素皮质素受体-4基因的克隆与序列分析

对牦牛黑素皮质素受体-4（MC4R）基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展牦牛MC4R基因与其肥胖性状的相关分析以及基因定位、表达调控等研究提供理论基础。首先采用特定引物对牦牛MC4R基因进行PCR扩增、克隆和测序,然后用B ioEd it7.0.0软件拼接MC4R基因全序列,用DNAMAN5.2.2软件对编码序列进行翻译,用DNAStar6.13比对后比较基因和氨基酸序列同源性。实验获得牦牛MC4R基因全长1343bp,其中编码序列全长999bp,共编码332个氨基酸残基的蛋白质。牦牛MC4R基因序列与普通牛、人、食蟹猴、猪、狗、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼、金鱼、东方鲀和河豚的同源性分别是99.5%、85.5%、84.9%、88.1%、86.7%、83.9%、83.8%、75.5%、61.2%、59.5%、65.3%和64.6%,由此推导的氨基酸序列同源性分别是99.1%、91.9%、91.9%、93.1%、92.2%、90.4%、89.8%、84.0%、66.7%、65.7%、67.2%和66.7%。本研究成功的克隆了牦牛的MC4R基因,表明其在物种间具有较高的保守性。     

牦牛UCP1基因生物学特性及组织表达分析

旨在克隆牦牛解偶联蛋白1(UCP1)基因序列,并对其进行生物信息学分析,进一步研究该基因在牦牛各组织的表达规律.以牦牛为实验对象,利用RT-PCR克隆得到牦牛UCP1基因全长序列,生物信息学分析牦牛CDS区,qPCR检测UCP1基因在牦牛不同组织中的表达模式.结果表明,UCP1基因全长为954 bp(GenBank No.MW345537),其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)全长为942 bp,编码313个氨基酸.蛋白分子特性预测UCP1蛋白为不稳定疏水性蛋白,存在跨膜结构域以及多个磷酸化位点.二级结构和三级结构预测显示,UCP1蛋白由无规则卷曲、α螺旋和延伸链三者交替出现.牦牛UCP1基因的核苷酸和氨基酸序列与普通牛的相应序列相似度最高,同源性分别为97.63%和96.76%;与斑马鱼的核苷酸序列和氨基酸序列相似度最低,分别为62.58%和64.29%.组织表达分析发现UCP1在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脂肪、背肌、半腱肌中均有表达,但在肾中的表达量最高,肾与其他组织之间差异显著(P0.05).不同品种牦牛UCP1基因的差异表达分析发现,其在麦洼牦牛背最长肌、肝中的表达量均显著高于金川牦牛(P0.05和P0.0001).这些结果为丰富牦牛UCP1基因的功能研究提供了参考依据.     

牦牛雌激素受体ERα和ERβ基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异.根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布.结果表明,分别获得2 100 bp ERα(Gen Ban K登录号:KJ011123)和1 791 bp ERβ(Gen Ban K登录号:KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸.多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5%和53.9%-99.1%.荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ.此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低.而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之,心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低.为进一步了解牦牛ERα和ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础.     

九龙牦牛CAST基因部分序列的克隆及其表达差异研究

根据牛钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin, CAST） 设计并合成一对引物,从九龙牦牛肌肉组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增获得九龙牦牛CAST基因部分片段,利用SQRT-PCR技术检测九龙牦牛各组织中CAST mRNA的表达差异．结果,成功克隆九龙牦牛CAST部分cDNA序列485bp,获得GenBank登录号为FJ483833;用DNAman软件分析发现九龙牦牛CAST基因与普通牛的核苷酸同源性依次为99％;SQRT-PCR组织表达检测表明,CAST基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪中均表达,在心脏中表达最高,在脂肪组织中表达最低．     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析.结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型.在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率.麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大.     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5''''调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’；下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD1S-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97．65％，云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96．8％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．4％。     

牦牛雌激素受体ERα和 ERβ 基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异。根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布。结果表明,分别获得2 100 bp ERα(GenBanK登录号：KJ011123)和1 791 bp ERβ(GenBanK登录号：KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸。多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5% 和 53.9%-99.1%。荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ。此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低。而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之, 心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低。本研究为进一步了解牦牛ERα 和 ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础。