脂肪间充质干细胞冻存及成骨诱导的实验研究

研究了脂肪间充质干细胞(ADMSCs)冻存的条件,观察低温冻存对ADMSCs的一般生物学特征及成骨分化潜能的影响。酶消化法分离培养人ADMSCs,液氮中冻存6月,复苏后倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况,台盼蓝染色检测存活率,MTT法绘制生长曲线,地塞米松、左旋抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、1,25-(OH)2VitD3成骨诱导,免疫细胞化学染色行成骨鉴定。人体脂肪组织中存在ADMSCs,经冻存复苏后,细胞存活率较高,细胞形态及生长曲线与冻存前无明显差别,经成骨诱导后仍可表达骨钙素(OC)和I型胶原。证实人ADMSCs可以耐受体外低温冻存,且能够保持稳定的一般生物学性状及成骨分化潜能。     

兔血清制备及兔来源细胞培养实验

目的制备兔血清,用于兔来源细胞的培养。方法通过兔股动脉采血,4℃冷藏过夜后析出血清。分别比较含10%兔血清和10%胎牛血清的DMEM培养液中细胞形态和增殖性能及冻存存活率。结果使用兔血清培养细胞分裂指数约为1%~2%,冻存存活率为90%;使用胎牛血清细胞分裂指数约为0.5%;细胞冻存存活率为85%。结论兔血清制备方法简便易行,所获兔血清对兔来源的细胞在增殖性能和冻存存活率方面均优于胎牛血清,适宜兔源组织的培养。     

BMSCs 过表达 BMP-4 复合同种异体骨修复软骨缺损

摘要:目的针对关节软骨损伤后修复困难,采用腺病毒( Ad)载体介导骨形态发生蛋白( BMP-4)修饰骨髓间充质干细胞( BMSCs) ,并复合同种异体骨软骨柱支架,以期实现关节软骨有效再生。方法制备同种异体骨软骨柱,BMSCs过表达BMP-4复合同种异体骨修复关节软骨损伤,膝关节标本取材大体观察及分析,HE、番红固绿、Masson及免疫组化检软骨再生情况。结果HE、番红固绿、Masson及免疫组化均提示实验组能显著促进缺损再生,并提高新生组织软骨含量。结论过表达BMP-4复合同种异体骨支架能显著促进软骨缺损再生,修复软骨损伤。     

BMSCs与PLGA支架构建组织工程化骨软骨复合组织

目的:探讨同种异体骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养后种植到孔径和孔隙率不同且复合不同胶原和生长因子的PLGA支架上再种植到大鼠肌袋内构建组织工程化骨软骨复合组织的可行性。方法:制作复合BMP-2和Ι型胶原PLGA支架与复合bFGF、TGF-β1和Ⅱ型胶原PLGA支架后把两者用生物蛋白胶粘合形成复合支架,把体外培养扩增的BMSCs种植到复合支架上,植入实验组A组、对照组B组、空白组C组SD大鼠肌袋内,于术后4、8、12周取材,分别行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化、ALP染色、扫描电镜、透视电镜观察。结果:实验组大体标本成骨区呈白色类骨样组织,质硬,成软骨区呈乳白色类软骨样组织,质较硬,两区融合;扫描电镜观察可见成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞,透视电镜尚可见细胞浆内有大量的线粒体和内质网,并见大量胶原分泌,与对照组、空白组有明显区别,组织学评分表明A组较B、C两组差异具有统计学意义(P0.05)。结论:BMSCs体外分离扩增后种植到孔径和孔隙率不同且复合不同胶原和生长因子的PLGA支架上再植入动物肌袋可构建骨软骨复合组织。     

miRNA在人骨髓来源间充质干细胞成骨诱导分化过程中的表达

观察miRNAs在人骨髓来源间充质干细胞成骨诱导分化过程中的表达情况。以从骨髓中分离培养的MSCs及成骨诱导培养后的细胞为实验对象,利用基因芯片检测miRNAs的表达情况,由SAM分析得到MSCs较其诱导培养细胞中差异表达的miRNAs,再进行生物信息学分析。分离培养出的MSCs经成骨诱导培养14 d后,已具有成骨细胞特性;经芯片检测并SAM分析,成骨诱导培养的细胞较MSCs高表达的miRNAs有7个:hsa-miR-363*、hsa-miR-483、hsa-miR-590、hsa-miR-130a、hsa-miR-15b、hsa-miR-30c、hsa-miR-663;成骨诱导培养的细胞较MSCs低表达的miRNAs有6个:hsa-miR-192、hsa-miR-210、hsa-miR-128a、hsa-miR-224、hsa-miR-106a、hsa-miR-494。利用TargetScan预测其靶基因,并行生物信息学分析,其中hsa-miR-130a、hsa-miR-15b和hsa-miR-30c的预测靶基因多为维持干细胞特性的基因;而hsa-miR-106a和hsa-miR-494的预测靶基因多为参与骨形成及成骨分化的基因。为证明miRNAs参与调控MSCs的成骨分化过程提供了直接证据和研究基础。     

多孔CPC材料复合转染VEGF的骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损的实验研究

为研究转染血管内皮生长因子(VEGF)基因的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合多孔CPC构建的组织工程化骨对骨缺损的修复作用,用脂质体介导质粒pIRES2-EGFP/VEGF165转染大鼠BMSCs,与多孔CPC复合体外构建组织工程化骨,植入大鼠颅骨缺损模型,未转染VEGF165的组织工程化骨作对照。分别在4周、12周取材,以组织学组织形态学分析骨缺损修复情况.比较两组的骨形成差异。结果转染VEGF组骨缺损的修复效果明显好于未转染组。组织形态计量学分析显示,4周时,转染组材料内新生骨面积为31.9%,未转染组为19.7%。12周时,转染组材料内新生骨面积为75.9%,未转染组仅为49.7%。差异具有统计学意义(P<0.000 1)。转染组的骨形成速率明显快于未转染组,两者分别为分别为6.18±1.62μm/d和3.56±0.93μm/d。说明VEGF转染细胞组较对照组血供加强,骨缺损修复加速。     

组织工程骨在生物反应器内的构建与检测

用经绿色荧光蛋白标记的新西兰兔颅骨来源的成骨细胞复合到生物衍生骨支架材料上,在新型旋转壁式生物反应器内三维构建组织工程骨,同时与静态培养环境中构建的结果进行比较.每12 h取样一次,培养至1周后结束.分别进行组织学、免疫组织化学和代谢产物等分析.结果显示反应器中以两种密度接种和构建的组织生长良好,细胞仍保持正常的染色体形态,并且反应器中构建物的细胞扩增是静态培养的5倍.研究结果还表明,通过反应器内部流体对流所产生的应力刺激及其提供的三维培养环境,可提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性表达,从而完成成骨细胞的快速增殖与分化并缩短工程化组织的构建时间.本实验进一步证实了骨组织工程产业化的现实可行性.     

点击化学法构建多生长因子序贯控释型ECM及骨组织工程化研究

正我校生命科学学院聂磊博士2017年获批国家自然科学基金项目:点击化学法构建多生长因子序贯控释型ECM及骨组织工程化研究,项目编号:31700840.骨组织工程可以解决临床上自体骨和异体骨供源不足、交叉感染等问题,采用支架支撑细胞,通过生长因子对细胞的扩散、迁移和分化调控,构建骨细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM),完成血管化和成骨化等修复.从组织工程学和转化医学     

珊瑚／胶原／重组人骨形成蛋白-2复合人工骨修复兔颅骨缺损

为评价珊瑚／ 胶原／ 重组人骨形成蛋白２ 复合人工骨（ 简称复合骨） 的骨修复能力,将复合骨植入兔颅骨直径１５ｍ ｍ 的圆形缺损,以单纯珊瑚植入作对照;术后６ 周、１２ 周取材,通过组织学观察和计算机图像分析,评价其骨修复能力．发现复合骨植入区形成的骨组织量明显多于同期的珊瑚植入区（ Ｐ＜ ０ ．０１） ;术后１２ 周,复合骨完全被成熟的骨组织取代,其骨修复效果明显优于单纯的珊瑚．说明复合骨具有骨传导和骨诱导活性,骨修复能力较强,是一种较为理想的新型生物性植骨材料     

rhBMP-2对SD大鼠MSCs骨向分化的影响及机制研究

目的:通过观察重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖、骨向分化能力的影响,以及对内源性因子TGF-β1、Smad4和下游细胞因子Cbfα1的作用,阐释其对MSCs骨向分化影响可能的作用机制.方法:运用全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠MSCs;运用MTT法检测质量浓度分别为0、5、10、20、40、80、100ng/mL rhBMP-2对SD大鼠MSCs增殖活性的影响;以碱性磷酸酶(ALP)活性及ALP染色阳性率确定rhBMP-2的最佳促MSCs骨向分化浓度,并以该浓度对MSCs骨向分化进行干预.按是否添加经典成骨诱导液将实验分为:空白组,经典组,rhBMP-2组,rhBMP-2+经典组.通过检测ALP、I型胶原(Col I)、骨钙素(BGP)和钙化结节的表达,以评价各组骨向分化能力;通过检测TGF-β1、Smad4、Cbfα1 mRNA的表达,以评价各组促MSCs骨向分化的作用机制.结果:rhBMP-2的最佳促MSCs增殖质量浓度为80 ng/mL,最佳促MSCs骨向分化质量浓度为40 ng/mL.经典组和rhBMP-2诱导各组均能促进MSCs骨向分化,刺激TGF-β1分泌,并上调Smad4、Cbfα1 mRNA的基因表达,而TGF-β1在早期分泌量最高,提示其可能在MSCs早期骨向分化过程起重要作用.结论:rhBMP-2诱导各组均有促MSCs骨向分化的作用,可能是通过促进TGF-β1的分泌,启动TGF-β超家族/Smads信号通路调控MSCs的骨向分化.     

MSCs联合EPCs体外构建组织工程化血管的实验研究

目的为了探讨间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)联合内皮前体细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在体外构建组织工程化血管的可行性以及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)的作用。方法首先分离、培养、扩增小鼠骨髓来源的MSCs和EPCs。剪裁、消毒、胶原包埋聚羟基乙酸(Polyglycolic acido,PGA)支架材料。按EPCs组、MSCs组、EPCs联合MSCs组、EPCs联合MSCs加b FGF培养组将各组细胞分别接种到处理过的PGA支架上制成细胞、PGA复合物,将以上制成的复合物在体外培养1周时分别用HE染色及倒置显微镜观察细胞与PGA的相容性,培养8周时做HE及免疫组织化学染色检测CD34、α-SMA蛋白水平,并对免疫组织化学染色评分后分析细胞、PGA复合物培养情况及各组之间的差异。结果 1周时,大量细胞贴附在PGA支架纤维上,细胞与PGA相容性良好;8周时各分组免疫组织化学α-SMA染色均为阴性;联合组免疫组织化学CD34染色阳性,并评分明显高于EPCs组和MSCs组,且差异有统计学意义(P0.05);EPCs组染色评分明显高于MSCs组,且差异有统计学意义(P0.05);b FGF组与联合组之间染色评分无明显差异(P0.05)。结论 MSCs联合EPCs可在体外构建组织工程化血管,两种细胞联合应用明显优于单种细胞应用,单独的b FGF应用没有明显的促进作用。     

人胎肝MSCs的分离、鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化

目的:分离纯化人胎肝中的间充质样干细胞(mesenchymal-like stem cells,MSCs),观察化学因子诱导其定向分化的作用,并初步鉴定其生物学特性.方法:利用二步离心法、羟乙基淀粉沉淀法及细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎肝MSCs;流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨细胞分化并加以鉴定.结果:从人胎肝中成功分离纯化得到MSCs,P3代细胞有91.2%的细胞处于GO/G1期;表达CD29、CD44、CD105和CD166,不表达造血细胞标志CD15、CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L.在经典诱导条件下,人胎肝MSCs可向脂肪及成骨细胞分化.结论:人胎肝中含有较丰富的MSCs,人胎肝MSCs具有多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程和细胞治疗较为理想的种子细胞.     

慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响

运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响.     

珊瑚/胶原/rhBMP-2复合人工骨异位诱导成骨的实验研究

目的：弥补单纯珊瑚无骨诱导活性、骨修复能力弱等缺陷,给临床提供一种良好的骨移植替代材料。方法：将珊瑚与胶原和ｒｈＢＭＰ－２复合,制备出珊瑚／胶原／ｒｈＢＭＰ－２复合人工骨,将其植入大鼠背部肌肉陷窝内,以珊瑚／胶原和珊瑚／ｒｈＢＭＰ－２复合人工骨植入作对照;取材后通过组织学方法和图像分析评价其骨诱导活性。结果：珊瑚／胶原／ｒｈＢＭＰ－２植入后１周,在局部诱导出软骨细胞分化和软骨基质形成;４周形成含骨髓的板层骨;诱导成骨的量有明显的ｒｈＢＭＰ－２剂量依赖性（Ｐ＜０．０１）;而珊瑚／胶原和珊瑚／ｒｈＢＭＰ－２植入区均无骨或软骨形成。结论：珊瑚／胶原／ｒｈＢＭＰ－２复合人工骨具有良好的异位诱导成骨活性,是一种较理想的骨移植替代材料。     

珊瑚／胶原／rhBMP-2复合人工骨异位诱导成骨的实验研究

弥补单纯珊瑚无骨诱导活性,骨修复能力弱等缺陷,给临床提供一种良好的骨移植替代材料。方法;将珊瑚与胶原和ｒｈＢＭＰ－复合,制备出珊瑚／胶原／ｒｈＢＭＰ－２复合人工骨,将其植入大鼠中肌肉陷窝内,以珊瑚／胶原和有／ｒｈＢＭＰ－２复合人工骨植入作对照;取材后通过组织学方法和图像分析评价其骨诱导活性。     

重组合异种骨修复兔尺骨缺损的研究

经手术造成兔尺骨骨缺损 ,缺损区植入重组合异种骨 ,通过 X线、大体解剖学及组织学检查观察修复过程来研究重组合异种骨修复骨缺损的效果 .结果是植入的重组合异种骨与受骨床充分整合并完全修复骨缺损 .说明此重组合异种骨为一理想的自体骨替代物 .     

梯度蔗糖诱导黄皮胚轴脱水耐性后超低温保存

梯度蔗糖预培养能增强黄皮胚轴的脱水耐性,使胚轴含水量下降至17.6%仍保持活力,在含NAA和IAA的WPM培养基上可诱导植株再生.黄皮胚轴脱水至18%后分别采用直接冻存法、抗冻剂冻存法、微滴冻法和玻璃化法超低温保存都不能复活.玻璃化冻存后的胚芽超微结构基本完整,若能继续优化冻存和培养条件,有希望获得存活的胚芽及其再生植株.     

大块异体骨移植修复膝关节部位良性骨肿瘤术后骨缺损10例临床分析

目的探讨采用异体骨移植治疗膝关节部位良性骨肿瘤术后骨缺损的疗效.方法异体骨来源于外伤急死者.死后12 h内在无菌条件下取骨,经酒精、高温煮沸处理备用.对10例膝关节部位良性骨肿瘤进行病灶清除,将大块异体骨修整至适合骨缺损处形状后植入,空隙处再填充骨碎块.结果所有患者术后均无感染,无明显排斥反应.植骨处骨性愈合,与正常骨结构无任何差异,肢体功能恢复优良,能满足日常生活和工作需要.结论采用异体骨移植修复膝关节部位骨肿瘤术后较大骨缺损,临床效果良好,关节功能获得最大限度保护,取得满意效果.     

版纳近交小耳猪BMP的提取及其骨诱导活性的初步研究

目的 :观察版纳近交系小耳猪骨形成蛋白的成骨活性。方法 :用Urist方法从版纳小耳猪骨和普通猪骨中提取骨形成蛋白,SDS -PAGE凝胶电泳测定小耳猪BMP的相对分子量。将剂量为2mg、5mg的小耳猪和普通猪BMP分别植入4组小鼠股部肌袋 ,分别于术后第7天、14天和28天取材,通过拍摄股部X线片、组织学观察和测定组织中碱性磷酸酶活性 ,观察小耳猪BMP诱导成骨活性。结果 :小耳猪BMP是一含14、22、27、36、48、66KD六种成分的蛋白多肽 ,所有BMP植入组放射学观察均未见明显高密度影形成。组织学观察BMP植入第7天可见大量间充质细胞分化并向软骨细胞转化 ,第14天有大量软骨形成 ,第28天见成熟板层骨并有骨髓形成。ALP活性测定结果显示5mgBMP植入组ALP活性明显高于2mgBMP植入组 ,但同等剂量的小耳猪BMP和普通猪BMP植入组的ALP活性无差异。结论 :版纳近交小耳猪BMP具有较好的成骨诱导活性 ,且sepBMP的成骨能力与植入剂量有关 ,但其成骨诱导活性与相同剂量的普通猪BMP相比无明显差别。     

兔心房来源非心肌细胞的分离培养

建立一种兔心房组织来源的非心肌细胞体外培养模型,为心血管药理实验、病毒学实验及组织工程的研究提供实验平台.无菌条件下取兔心房壁组织,将组织分离成2 mm×1 mm小块,采用植块法以5行4列的形式种植于培养瓶中,加入M199或MEM培养基对兔心房组织进行原代培养.待长成单层时胰酶消化收集细胞,并进行传代培养和细胞冻存.该方法获得了大量活力良好的兔心房壁组织来源的非心肌细胞,倒置镜下观察细胞多呈短梭形,以及少量的三角形、柱形和卵圆形细胞,细胞核部位隆突,胞浆均匀清亮.经体外传代培养至16代,冷冻复苏以后,细胞仍生长良好.