烟草叶绿体分裂基因NfFtsZ2-1的克隆与功能分析

FtsZ蛋白在叶绿体的分裂过程中担负着重要作用.高等植物中FtsZ蛋白的陆续发现和功能分析加深了人们对叶绿体分裂机制的认识.植物中的ftsZ基因可分为两个明显不同的家族,在对烟草ftsZ1家族的研究基础上,对烟草ftsZ2家族成员的NtFtsZ2-1基因做了进一步的功能分析.研究结果表明,NtFtsZ2-1在叶绿体的分裂过程中发挥着重要作用,该基因的过量与减弱表达均对叶绿体的形态和数目产生了明显的影响.     

烟草ftsZ基因表达对质体发生的影响

FtsZ是广泛存在于原核生物和高等植物中的一种功能蛋白,它控制着原核细胞和质体的分裂过程.为进一步认识原核细胞和质体分裂的分子机制及真核细胞的起源和进化等重要问题,研究了该基因的表达调控特征.从烟草克隆ftsZ cDNA,构建了谷胱甘肽转移酶(GST)与FtsZ融合蛋白的表达质粒,并将其导入到在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下能高效表达的大肠杆菌JM109中.高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,用以免疫兔子制备抗血清.免疫印迹法表明烟草ftsZ基因的表达具有明显的组织器官特征,在质体(叶绿体)分裂活跃的部位表达强,其表达量为幼嫩花瓣>幼叶>幼根>老叶>茎.黑暗培养1d对ftsZ基因表达似乎无影响,随黑暗培养时间延长,FtsZ蛋白表达逐渐降低,叶绿体转化成为体积小、数目众多(增加2～3倍)的淡黄色或白色质体.该实验结果证明,光对植物ftsZ基因表达很可能无直接影响,ftsZ基因表达的强弱是决定质体(叶绿体)分裂和细胞中质体(叶绿体)数目多少的主要原因之一.     

烟草质体分裂相关基因NtFtsZ cDNAs的克隆及功能分析

通过RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)方法从烟草中克隆了两个质体分裂相关基因NtFtsZ1-1和NtFtsZ1-2的cDNA.推导的氨基酸序列分析表明,两者均具有FtsZ蛋白的典型特征和GTP结合位点;N端氨基酸序列分析也表明,NtFtsZ1-1和NtFtsZ1-2都具有质体导肽特征,发现了在高等植物中至少存在两个具有质体导肽的FtsZ;基于氨基酸序列的分子谱系分析也支持这一结果.核酸杂交表明两者在植物的不同发育时期具有相似的表达谱.将这两个基因转入E.coli中表达,它们能影响宿主菌的正常分裂,初步验证了其功能.这些研究提示在高等植物中FtsZ可能具有更多样化的功能.     

叶绿体CrFtsZ2蛋白对E.coli形态的影响

FtsZ蛋白在细菌的分裂中担任着重要作用,能够在分裂位点形成一个环状结构而控制细菌的分裂过程。胞内FtsZ蛋白浓度的异常升高或降低均可阻断正常的细胞分裂过程进而形成分裂异常的丝状菌体。我们为了进一步研究衣藻FtsZ蛋白的生物学活性,建立了CrFtsZ2-EGFP融合蛋白原核表达的对照体系。结果表明：低浓度IPTG促进转化有表达质粒pLGZ2的大肠杆菌JM109伸长,高浓度IPTG则抑制其伸长;融合表达质粒的过量表达导致宿主菌形成了丝状菌体,不但菌体长度随浓度梯度而有规律性的变化,而且CrFtsZ2-EGFP融合蛋白沿着宿主菌体的纵轴方向有规律地聚集成荧光点或荧光带。更进一步验证了衣藻CrFtsZ2蛋白的功能。     

龙胆FtsZ基因的克隆及其在花瓣发育过程中的表达

以用RT-PCR从龙胆中克隆的FtsZ基因的cDNA片段(约800bp)作为探针,从cDNA文库中筛选到全长cDNA.递推氨基酸序列分析表明,该cDNA编码的多肽具有FtsZ蛋白的典型保守序列,N端氨基酸序列具有质体导肽特征,推测在叶绿体内起作用.随着龙胆花瓣发育进程,与质体分裂相关的FtsZ基因表达逐渐减弱,类胡萝卜素生物合成代谢途径中的Zds基因表达逐渐增强;叶绿素含量降低而类胡萝卜素含量增高,叶绿体逐渐转变成花色体,花色由绿转黄.     

酵母双杂交泛素系统分析CLV1/2/3间的相互作用

CLAVATA(CLV)家族在拟南芥茎顶端分生区干细胞增殖与分化平衡的调节中发挥至关重要的作用.CLV基因家族编码受体蛋白激酶CLV1、受体样蛋白CLV2和细胞外多肽信号配基CLV3,前期研究表明,CLV1和CLV2可能以复合体形式接收并向胞内传递CLV3的信号,而受体激酶CORYNE(CRN)参与CLV3信号转导途径,可能和CLV2相互作用组成二聚体与CLV1形成平行独立的通路来应答CLV3信号.采用酵母双杂交泛素分裂系统研究了CLV家族蛋白之间的相互作用,研究结果表明CLV1的胞外域与CLV3和CLV2分别存在相互作用,这进一步为CLV家族受体-配体复合体的形成提供了证据.     

陆地棉GhBFT1基因的克隆、表达及亚细胞定位分析

植物的磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族(PEBP)分为3个亚家族,其中BFT属于TFL1亚家族成员,在维持植物分生组织的无限生长方面起着重要作用。棉花是重要的经济作物,但BFT1家族成员目前没有相关的研究报道。本研究克隆Gh BFT1基因,开展基因表达、亚细胞定位分析,初步探索Gh BFT1基因在棉花中可能的功能。通过RTPCR的方法从新陆早33中克隆了一个Gh BFT1同源基因,ORF长度为525 bp,推测编码174个氨基酸,包含TFL1亚家族蛋白保守氨基酸位点His88/Asp144,同源建模分析表明Gh BFT1蛋白三维结构与TFL1家族蛋白的结构非常相似,进化树分析表明Gh BFT1基因与番木瓜、榴莲、哥伦比亚锦葵、可可等亲缘关系更为接近。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析表明Gh BFT1基因在棉花根、雄蕊、开花当天和开花后1天的胚珠中表达量较高。构建融合表达载体35S∶Gh BFT1-GFP,转化至农杆菌GV3101,然后转化本氏烟草叶片中,用激光共聚焦显微镜观察烟草叶表皮细胞,发现细胞质和细胞核中均有强烈的绿色荧光信号,表明Gh BFT1是细胞质和细胞核定位的蛋白。本研究对棉花家族基因做了一定的功能探索,为将来深入研究棉花BFT1基因在棉花生长发育和开花转变中的功能奠定基础。     

大麦叶绿体分裂的研究

报道了大麦叶绿体分裂的全过程。发现叶绿体是在长轴的中部或近中部产生缢痕、逐渐紧缩并断裂为两个子叶绿体的。并对遗传性黄化大麦叶绿体的结构特征、叶绿体分裂机制、同步性及子叶绿体的大小等进行讨论。     

黄瓜幼叶叶绿体分裂的电镜观察

本文以黄瓜幼叶为材料，在电镜下观察到了叶绿体的二分分裂，其分裂方式以哑铃状分裂为主。     

利用泛素分裂系统筛选AtTR1相互作用蛋白质

以AtTR1作为诱饵蛋白利用泛素分裂系统在拟南芥cDNA文库中筛选与拟南芥AtTR1基因相互作用的蛋白质.运用营养缺陷型培养基和X-Gal显色、PCR扩增及酶切分析等实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对.通过泛素分裂系统筛选到可靠的AtTR1相互作用蛋白质,测序比对后,选取HMA与AtTR1通过GST pull-down进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用,这对进一步研究AtTR1及其相互作用蛋白质在植物耐热中的作用和耐热分子机制奠定了基础.     

遗传物质的两个控制作用——分裂细胞内的遗传物质对将分裂出细胞的两个控制作用

本文旨在证明对于由受精卵发育成的个体而言，在其个体发育中，分裂细胞内的遗传物质对将分裂出的细胞，具有如下两个控制作用：1)按照“各种性状的细胞、组织在体内出现规律”确定将分裂出的两个细胞性状的作用.2)按照上述规律确定上述两个细胞，在体内出现位置的作用.文中对上述结论的证明是经由揭示“各种性状的细胞、组织在体内出现规律”的途径来实现的.研究中分析了由含有相同遗传信息的受精卵所发育成的个体，在各个体生长发育的对应阶段，各个体内对应位置上，出现相同性状器官、组织、细胞的原因及出现上述现象的具体过程.同时，引入符合个体发育特征的重要概念.表明上述物质对将分裂出的细胞，具有上述两个控制作用.     

AtOSAK1在植物氧化胁迫响应中的功能研究

植物类蛋白激酶ABC1家族(Activity of bc1 complex)在植物生长发育及响应非生物胁迫中扮演着重要的作用.该课题组克隆并研究了ABC1家族中一个的基因At OSAK1.半定量RT-PCR检测及启动子驱动GUS报告基因分析的结果显示,At OSAK1基因的表达无组织特异性,且受甲基紫精(MV)的诱导表达.At OSAK1-GFP亚细胞定位显示,At OSAK1蛋白定位在叶绿体中.不同浓度MV处理条件下,过表达At OSAK1植株的种子萌发率和存活率比野生型(Col-0)和突变体osak1高.这些研究表明,At OSAK1基因参与了抗氧化胁迫的响应.     

桃钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶基因家族鉴定与分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CIPKs)在植物生长发育和抗逆过程中发挥着重要作用。为了对桃中CIPK家族基因进行系统分析,利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CIPK家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有18个CIPK基因,分布于桃的6条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CIPK蛋白均含有2个保守的PKinase和NAF结构域。进化树分析表明CIPKs可分为2个亚家族。Net Phos 2.0 Server结果显示Pp CIPKs存在着大量的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示桃CIPK蛋白的功能提供重要的理论基础。     

过量表达SlOPA3-like基因对烟草叶片叶绿体发育的影响

3型视神经萎缩蛋白(Optic atrophy type 3,OPA3)普遍存在于真菌、植物和动物中,但它在植物中的功能尚不清楚。本研究构建了番茄OPA3-like (SlOPA3L)基因的过表达载体35S∶∶SlOPA3L并遗传转化烟草。与野生型烟草叶片相比,过量表达SlOPA3L基因的转基因烟草的子叶呈花叶状、部分组织失绿,转基因烟草的少数早期真叶呈花叶表型,随着叶片发育后又逐渐恢复正常。转基因烟草的叶片细胞表型分析表明:真叶花叶的叶片的海绵组织和栅栏组织发育受到显著的影响。这些结果表明:Sl OPA3L基因可能影植物叶片细胞的分裂和参与植物叶片发育早期的叶绿体形成。     

SUN-domain蛋白家族在植物中的研究进展

SUN-domain蛋白家族是植物细胞膜上核骨架与细胞骨架连接复合体(LINC)的重要组成成分,在细胞核的形态、定位和迁移以及染色体移动和配对的过程中均发挥着重要作用.由于功能域在编码基因中所在位置不同,SUN-domain蛋白家族可以分为羧基端SUN-domain蛋白(Cter-SUN)亚家族和中间SUN-domain蛋白(Mid-SUN)亚家族. Cter-SUN蛋白定位于内核膜上,而Mid-SUN蛋白在核周质、内质网上均有出现.受基因复制事件和选择性剪切事件的影响,SUN-domain蛋白家族在不同植物中的成员数目和功能作用也存在一定的差异.从系统进化上来看,SUN-domain蛋白家族的起源古老,可能出现在单细胞生物进化为多细胞生物之前.根据目前对植物SUN-domain蛋白的理解,文章阶段性总结了该蛋白家族在植物各主要类群中的成员组成、编码基因的特点和表达模式以及各蛋白的功能特性等方面的研究进展,为深入理解该蛋白家族在植物进化中的作用奠定了基础.     

基于叶绿体基因组全序列分析真叶植物叶绿体基因的适应性进化

 真叶植物包括蕨类、裸子植物和被子植物。迄今已积累有较为丰富的真叶植物叶绿体基因组全序列数据。选取了29种真叶植物的叶绿体基因组全序列,采用PAML 软件基于位点间可变ω模型,分别分析了蕨类、裸子植物和被子植物叶绿体基因的适应性进化。结果显示：① 蕨类、裸子植物和被子植物各有6.5%、7.5%和19.2%的叶绿体基因受正选择作用;被子植物经历正选择的叶绿体基因明显比蕨类和裸子植物为多;② 被正选择作用的叶绿体基因主要是遗传系统和光合系统基因,它们的编码产物涉及叶绿体蛋白质合成、基因转录、能量转化与调节及光合作用等过程。推测叶绿体功能基因可能在真叶植物对陆生生态环境的适应过程中起着重要作用。     

甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器，大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码，在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白，转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白，它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用，构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比，Toc33基因的表达调控研究较少，该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此，在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上，采用单引物PCR方法进行染色体步移，克隆出Toc33基因的启动子，为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．     

藜麦4,5-多巴双氧化酶基因(CqDODA)家族的全基因组鉴定与分析

基于藜麦高质量基因组数据，鉴定了18个CqDODA基因家族成员，并对其进行了系统分析。结果表明：大多数CqDODA蛋白理化性质差异较小；根据CqDODA基因的亲缘关系可分为三支，分支1中的8个CqDODA基因在甜菜素合成中具有重要的作用；分支1的CqDODA基因结构差异较小，并且蛋白高度保守；CqDODA基因在逆境胁迫或者激素处理下可能存在响应。本研究结果可为深入研究CqDODA基因在藜麦甜菜素合成中的作用提供理论依据。     

真核生物中支架蛋白家族(IQGAP family)的分子进化分析

支架蛋白家族(IQGAP family)广泛存在于真核生物中,在细胞的信号转导、骨架运动、细胞分裂的过程中都有着重要功能.研究分析IQGAP蛋白家族的分子进化,有助于深入全面地了解整个IQGAP蛋白家族在不同物种中功能.通过使用相关数据库,在35个真核生物物种中检索到了70个支架蛋白家族成员的序列信息,并对其进行了系统的分子进化研究.我们发现:支架蛋白家族基因广泛存在于后生动物(Metazoan)、真菌(Fungi)、变形虫界(Amoebozoa)以及其他一些真核生物中,提示支架蛋白存在于最后的真核生物的共同祖先(Last Eukaryotic Common Ancestor,LECA).系统发育分析表明脊椎动物的IQGAP蛋白和非脊椎动物中代表性IQGAP基因共享一个共同的祖先基因,单个的IQGAP祖先基因在早期脊椎动物中(在四足总纲和硬骨鱼纲的分离之前),发生了两次基因复制事件,导致现存的脊椎动物中3组IQGAP基因(IQGAP1,IQGAP2,IQGAP3)产生.     

表达千穗谷Ah—AMP基因的转基因烟草抗病性研突

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amarathus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜抗菌肽(Ah—AMP)的核基因片段，序列分析结果表明该基因长261bp，编码一个由86个氨基酸组成的Ah—AMP前体多肽。在构建Ah—AMP基因的植物表达载体pBinAH916后，通过根癌土壤杆菌介导方法转化了烟草。转化再生植株和T1代转基因烟草的PCR和Southern blot分析表明，AA—AMP基因已整合到烟草的染色体中，并为单拷贝整合。T1代转基因烟草的Nouthern blot分析结果表明，AA—AMP基因在转基因烟草中至少在mRNA水平上能正常表达。对T0代转基因烟草进行烟草青枯病的抗病性试验，筛选出两株抗性较强的植株。对T1代抗青枯病的统计分析发现，其抗病性比起始品种SRl分别提高了2．24和1．62个级别；其病情指数比起始品种降低49．6％和37．3％。对黑烃病也表现一定的抗性，主要表现在推迟发病时间，减缓发病速度上。这些结果表明AA—AMP基因在植物抗病基因工程研究中可能是一个有潜在应用价值的基因。