利用eIF4E分离纯化非编码RNA的新方法

人翻译起始因子eIF4E是特异性识别并结合mRNA帽结构的蛋白质.该文通过克隆人源基因eIF4E,并利用原核细胞大肠杆菌BL21成功表达了具有帽结合功能的eIF4E蛋白,利用该蛋白亲和纯化分离得到了具有帽子结构的RNA.通过对比用oligo(dT)分离得到的非编码RNA,eIF4E法得到了更多种类的非编码RNA.本研究为非编码RNA的分离与发现提供了一个重要的工具.     

Si-1基因中一个多态位点的初步分析

 通过PCR-RFLP技术分析了Si-1基因的外显子在肿瘤样本与正常人群外周血液样本的突变情况,初步确定了Si-1基因的第15号外显子的第56位发生点突变,突变类型为C—T的置换突变,其编码的P(脯氨酸)变化为S(丝氨酸).在正常人群外周血液样本中的突变频率为14%,而在肿瘤中的突变频率为24.7%,尤其在肠癌中的突变频率高达51.5%.上述结果表明Si-1基因的外显子的突变与肿瘤间有一定关系.     

云南妇女卵巢癌中p21WAF基因有较高的31位密码(Ser/Arg)突变

 通过PCR-SSCP分析和序列分析,对取自云南地区的44例妇女卵巢肿瘤样本的p21^WAF基因Ser³¹密码子的突变进行了分析.结果表明35例恶性肿瘤样本中有15例发现有突变,突变率为42.9%;9例良性肿瘤中有4例出现突变,突变频率44.4%;在另外6例正常组织中出现1例突变,突变率为16.7%.这一结果表明,云南妇女在这一基因位点存在多态性,这一位点的突变具有发生卵巢癌的趋势.     

油菜ICE1基因表达载体构建及转化烟草

从油菜中克隆得到了ICE1基因的开放阅读框序列.构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体,经农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株.通过PCR检测,目的基因成功转入烟草中.将转油菜ICE1基因的烟草和非转基因烟草置于2℃处理7 d,非转基因烟草出现萎蔫,转基因烟草没有明显变化,非转基因烟草丙二醛浓度明显高于转基因烟草.将转基因烟草与非转基因烟草分别置于0、-2、-4℃各1 h后,转基因烟草APX、SOD活性明显高于非转基因烟草.     

番茄真核翻译起始因子4E基因RNA干涉及其抗病毒特性研究

植物真核翻译起始因子4E（eIF4E）在蛋白质翻译过程中发挥重要作用．最近研究表明eIF4E在参与植物病毒互作,影响病毒在寄主中复制和侵染过程．文中通过RNA干涉调控番茄eIF4E表达,鉴定eIF4E在植物病毒互作中的作用．根据数据库假设性一致序列（TC171564,TC170275）分别克隆了番茄“中蔬五号”SleIF4E基因及其异构体基因SleIF（iso）4E．构建了SleIF4ERNAi抑制表达载体pSL4D,通过农杆菌介导的方法导入番茄品种“中蔬五号”基因组．PCR检测和Southern blot结果表明,目标基因已整合到番茄基因组中．通过半定量RT-PCR对转基因番茄进行eIF4E表达分析,表明pSL4D转化番茄中eIF4E得到不同程度抑制．转基因植株分别接种PVY和CMV两种病毒,病毒ELISA测定和病毒RNA积累量分析表明,pSL4D转化植株相对于对照组均获得不同程度的病毒抗性,番茄eIF4E参与PVY的复制或侵染寄主过程．就不同病毒而言,RNAi对PVY抗性的调控效果比CMV调控效果好,抑制PIF4E表达可提高植物对PVY的抗性．     

广东分离株HPV16型L2与重组E7融合蛋白原核表达载体的构建

分析广东分离株HPV16型的L2和E7基因结构,并对E7的4个功能区重新排列组合形成失去致癌作用但其抗原表位不改变,其命名为rE7,构建pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2 4个原核表达质粒.采用PCR技术从广东分离株HPV16基因组中扩增L2基因;用重叠PCR技术人工合成rE7基因和L2-rE7、rE7-L2融合基因,并构建到原核表达载体pET-28a(+)上. 成功扩增广东分离株HPV16型 L2基因,经重叠PCR技术成功得到rE7、L2-rE7和rE7-L2基因并成功构建了原核表达的4个载体:pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2. 广东分离株HPV16型L2基因与中国标准株有9处不同,同源性为99.37%,其编码氨基酸序列有8处突变. 成功合成失去致癌作用的基因rE7及构建4个原核表达载体.     

烟草雄性不育突变株Y1 2的初步研究

植物雄性不育材料 ,不仅在生产上为育种提供资源 ,同时也是研究植物雄性生殖发育分子机制的有用材料 .雄性不育的材料通常是由自然突变或通过化学及物理诱导等方法获得的 ,这些方法尽管容易得到大量的突变子 ,但所获得的突变基因却不易分离 .目前已经发展了一种基因标签法 ,通过插入已知序列的外源片段或转座子作为标签 ,使突变基因的克隆相对容易 ,该方法已成为某些实验室分离发育基因的常规方法 [1～ 3] .我们报道利用转基因方法获得烟草雄性不育突变株 Y1 2及对其初步研究情况 .1　材料和方法1 .1　材料1 .1 .1　烟草品种　革新 1号 ( N…     

应用DHPLC检测多巴胺D2受体基因在中国人群中的多态性

通过变性高效液相色谱 (DHPLC)和DNA测序在 4 1个中国汉族人DNA样本中检测DRD2基因编码区和拼接区的单核苷酸多态性 (SNP) ,结果发现 3个SNP :Intron5的 2 77G/A、Exon7的 4 2C/T和Exon7的 1 2 9T/C .Intron5 2 77G/A是在中国汉族人群中发现的新SNP ,Exon7 4 2C/T和 1 2 9T/C在NCBIdbSNP中已有相应记录 (分别为rs4 986 92 1和rs6 2 75) ,它们均导致DRD2基因的同义突变 ,其中Exon7 1 2 9C等位基因频率在研究样本中高达 4 3.9% .这些结果为在中国汉族人群中开展DRD2基因相关的群体遗传学研究提供了遗传标记 .另外 ,还探讨了DHPLC检测突变的干扰因素及控制措施 ,为国内同行开展类似工作提供参考     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpG的鉴定及其变异分析

根据水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)hrp基因的序列设计引物,通过PCR方法从水稻白叶枯病菌JXOⅢ和PXO99A菌株中扩增得到核苷酸序列完全一致的hrpG基因.以该基因为探针与JXOⅢ/pUFR034基因组文库中含有hrpX克隆pUHRX245(36.8 kb)的4个亚克隆进行southern blot分子杂交,确定在亚克隆pB1中1.3 kb大小的片段和AE4(3.0 kb)片段中存在hrpG同源序列.测序结果表明,在pB1中有586个碱基序列,在AE4中有206个碱基,共同构成完整的hrpG基因,且与已知的hrpX基因是毗邻的.以同样方法从水稻白叶枯病菌PXO99A菌株的hrp-突变体M16中扩增得到hrpG基因对应位置的同源突变序列.序列分析表明其有意义突变为541位的C→T的突变,从而导致亮氨酸变为苯丙氨酸(Leu→Phe).将hrpG基因和突变序列分别导入突变体M16中,转移结合子M16/hrpG(PXO99A)恢复了其在烟草上的过敏反应和在水稻上的致病性,而突变序列的结合子M16/hrpG(M16)则不能使其恢复功能,从而确定M16是由于单个碱基的突变所引起的功能突变.经过对基因及其产物的比对发现,对于第Ⅱ组hrp调节基因hrpG的变异,种间变化明显高于种内不同致病变种的变化.     

FASAY技术在肝癌p53基因功能突变检测中的应用

酵母中分离的等位基因功能分析技术(functional analysis of separated alleles in yeast,FASAY)是一种检测基因结构与功能关系的有效方法.利用FASAY技术结合DNA测序对28例临床原发性肝细胞癌手术样本中的p53基因结构突变与P53蛋白的功能进行了检测.结果发现在这些肝癌组织样本中,FASAY检测的阳性结果为15例,p53基因突变率为53.6%.cDNA测序的结果表明15例FASAY阳性样本均发生了p53基因突变,而13例FASAY阴性样本中未检测到基因突变.在15例p53基因突变肝癌样本中,有8例249位密码子突变,其中包括一例首次报道的249Thr双点突变(GC746.GC747→CG746.TA747),其余均为249Ser突变.研究结果表明,FASAY是一种灵敏的检测HCC中的p53基因结构与功能突变的技术,它可推广应用于肝癌临床样本的研究.     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

表达千穗谷Ah-AMP基因的转基因烟草抗病性研究

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amarathus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜抗菌肽(Ah-AMP)的核基因片段,序列分析结果表明该基因长261bp,编码一个由86个氨基酸组成的Ah-AMP前体多肽.在构建Ah-AMP基因的植物表达载体pBinAH916后,通过根癌土壤杆菌介导方法转化了烟草.转化再生植株和T 1 代转基因烟草的PCR和Southern blot分析表明,Ah-AMP基因已整合到烟草的染色体中,并为单拷贝整合.T 1 代转基因烟草的Northern blot分析结果表明,Ah-AMP基因在转基因烟草中至少在mRNA水平上能正常表达.对T 0 代转基因烟草进行烟草青枯病的抗病性试验,筛选出两株抗性较强的植株.对T 1 代抗青枯病的统计分析发现,其抗病性比起始品种SR1分别提高了2.24和1.62个级别;其病情指数比起始品种降低49.6%和37.3%.对黑胫病也表现一定的抗性,主要表现在推迟发病时间,减缓发病速度上.这些结果表明Ah-AMP基因在植物抗病基因工程研究中可能是一个有潜在应用价值的基因.     

杜洛克与梅山猪卵泡中Grb14、eIF4E和SNRPE基因的差异表达研究

为了探讨梅山与杜洛克母猪卵泡中差异表达基因对猪排卵与繁殖性状的影响,对在前期试验中通过消减杂交技术得到的EST杜大5、杜大46、杜大35进行了分析。序列分析结果表明,EST杜大5、杜大46、杜大35分别代表了Grb14、SNRPE、eIF4E基因。组织表达谱分析结果表明,这些EST在各个组织中均有不同程度的表达,其中Grb14基因只在肝脏、肾脏和卵巢、输卵管、黄体、垂体等繁殖相关器官高表达。荧光定量分析结果表明,这些基因在杜洛克猪大卵泡中的表达量均高于在梅山猪大卵泡中的表达量,其中SNRPE、eIF4E基因达到显著水平,在两猪种其他各级别卵泡中也有不同程度的表达差异,其中Grb14在杜M2中的表达量达到梅M2的2.13倍,差异显著,eIF4E基因在杜M1的表达量是梅M1的0.46倍,差异极显著。在猪种内大卵泡L、中等卵泡M2、中等卵泡M1、小卵泡S的相对表达量也有不同程度的差异。这些差异表达的基因可能影响卵泡发育和成熟,为深入了解这些基因在卵泡发育中的作用奠定了基础。     

转乙肝病毒表面抗原基因烟草发根的获得

构建了乙肝病毒表面抗原基因（HBsAg）植物表达载体,通过冻融法将HBsAg 基因转入到发根农杆菌LBA1314中,采用叶盘法将HBsAg基因导入到烟草中,获得了转基因烟草发根.对转基因烟草发根的GUS检测结果表明：转HBsAg基因烟草发根可以染成蓝色,而非转基因烟草的根没有染色反应.这说明gus基因在转HBsAg基因烟草发根获得了表达.     

eIF4E在非小细胞肺癌耐药性中的作用

探讨eIF4E对厄洛替尼耐药细胞株细胞增殖的影响及作用机制.在配对的厄洛替尼敏感和耐药细胞株(HCC827-EP、HCC827-ER)上,采用实时定量PCR检测mRNA水平的变化,Western Blot检测蛋白水平的变化;通过SRB检测细胞的生长和药物的抑制率的变化.以及用脂质体转染eIF4E的小干扰RNA,用上述方法检测多种信号分子mRNA、蛋白水平的变化,及对细胞生长和对药物抑制率的影响.结果显示,与HCC827-EP相比,eIF4E在HCC827-ER上高表达;HCC827-ER转染eIF4E siRNA的细胞生长速度明显减慢,从第3 d起差异具有统计学意义(P0.05),在相同浓度的厄洛替尼作用下,转染eIF4E siRNA的细胞具有更高的抑制率,差异具有统计学意义(P0.05).结论:下调eIF4E的表达能够增强厄洛替尼对NSCLC的抑制作用,eIF4E的高表达参与了厄洛替尼获得性耐药的产生.     

家蚕新的非编码RNA功能初探

构建了家蚕50～500 nt非编码RNA的cDNA文库,发现了189个新的ncRNA,其中一个小RNA-Bm-86在家蚕幼虫和蛹中的表达量显著高于卵和成虫.利用生物信息学软件对该ncRNA的特性及其与上下游基因的关系进行了深入分析,并利用Northern杂交和半定量RT-PCR技术对该ncRNA与其宿主基因在家蚕不同组织的表达情况进行了研究.结果发现,该ncRNA属于H/ACA box snoRNA家族,是由家蚕eIF5A基因的第二个内含子转录产生的,且在家蚕中没有明显的靶标位点.分析其上下游基因结构发现,在其上游263 bp处存在着一个可能的启动子位点,表明其有独立转录的倾向.进一步分析Bm-86与其宿主基因eIF5A在家蚕不同组织部位的表达情况发现,二者在表达上存在着负相关的关系,且该现象在丝腺中尤其明显.推测Bm-86可能通过影响eIF5A基因的表达参与到家蚕丝腺发育调控过程中.     

豆豉纤溶酶的定向进化

为提高豆豉纤溶酶的药用价值,通过易错PCR方法对来源于Bacillus subtilis DC-12的豆豉纤溶酶DFE基因进行突变并构建突变体文库,利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA对突变体文库进行筛选.通过3轮易错PCR最终获得催化效率提高的突变酶mDFE3.序列分析表明突变酶mDFE3基因发生了6处碱基突变,其中4处突变发生氨基酸取代,2处为同义突变;通过swiss-model repository模拟突变酶mDFE3的结构,显示3个突变氨基酸位于回环结构上,1个位于α螺旋上;酶动力学测定结果表明突变酶mDFE3的Km值由0.58mmol/L降低至0.45mmol/L,突变酶mDFE3的催化效率(kcat)是野生型的2.57倍.     

基于过表达技术的烟草NtGGPPS1基因功能的研究

将NtGGPPS1-T质粒和spCAMBIA1300载体分别双酶切(SalⅠ和KpnⅠ)后连接,转化,挑取单克隆,筛选得到植物超量表达载体spCAMBIA1300-NtGGPPS1,并通过农杆菌介导侵染栽培烟草K326,在获得阳性转基因烟草后,进行定量RT-PCR以定量分析烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1在转基因植株中的转录积累.同时,通过LC-MS和GC-MS检测转基因植株中质体色素和萜类化合物含量的变化.结果显示,与对照组相比,NtGGPPS1基因在编号为Nt1-OE1、2、3、4、7植株中表达上调,阳性转基因烟草中新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素6种质体色素,以及烟叶中代表性二萜类物质α-西柏三烯二醇(α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-CBD)的含量明显增加.以上结果表明,NtGGPPS1基因参与了烟草中质体色素和二萜类化合物的生物合成.     

利用植物生物反应器表达胸腺素α1的研究

胸腺素α1是胸腺肽中活性最高的组分,可以提高人体免疫力,通过组织提取或人工合成存在安全隐患和价格昂贵等问题.拟用植物生物反应器,转基因模式植物烟草表达胸腺素仅α1.通过已构建的植物双元载体p35S-2300-twin T-DNAs::Ta4::noster用农杆菌介导法转化烟草,在卡那霉素筛选压为50 mg/L时获得抗性烟草165株,经PCB和Southern blot分析证实,获得了17株独立转基因苗,阳性率10.30%,外源基因拷贝数为1-7个.还对利用含"twin T-DNA"植物双元表达载体转化烟草T0代的Tα4和nptII分别整合现象以及植物生物反应器生产胸腺素的前景进行了讨论.     

木犀草素抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化

为研究木犀草素在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中的作用,文章探讨木犀草素抑制脂质沉积的作用机制,选取3T3-L1前脂肪细胞作为研究对象,在其分化过程中添加木犀草素,利用噻唑蓝(MTT)实验研究木犀草素对3T3-L1增殖的作用;利用油红O染色确定其对3T3-L1前脂肪细胞脂肪化的影响;利用定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测木犀草素对3T3-L1脂肪化相关基因的表达影响。结果表明,20μmol/L的木犀草素可以降低3T3-L1细胞的脂肪化,减少脂质聚集,并且降低了3T3-L1细胞中脂肪化相关基因Pparγ、C/EBPα、Ap2和Fas等基因的表达。