一种筛选高产(+/-)-γ-内酰胺酶菌株方法的建立

(+)-γ-内酰胺酶能够拆分(+/-)-γ-内酰胺得到(-)-γ-内酰胺,(-)-γ-内酰胺酶能够拆分(+/-)-γ-内酰胺得到(+)-γ-内酰胺。目前只有几种具有(+/-)-γ-内酰胺酶的微生物被报道,都是用N-乙酰-L-苯丙氨酸做为唯一碳源从土壤里筛选能利用N-乙酰-L-苯丙氨酸的菌株,它们有可能具有(+/-)-γ-内酰胺酶,再用手性高效液相色谱分析法复筛。但是这种筛选方法有点盲目性,工作量大。本实验在此基础上,先利用经典的复制平板和茚三酮染色技术,再用氨基酸显色法复筛得到3株阳性菌株,最后用手性高效液相色谱分析法确认。结果筛选到的3号菌株具有(+)-γ-内酰胺酶功能,ee值达到100%,22号和29号菌株具有(-)-γ-内酰胺酶功能,ee值达到50%。此种筛选方法的建立,以后也可用于类似的易溶,又不显色底物的降解菌株和阳性克隆子的筛选。     

红腐乳中高产γ-氨基丁酸红曲霉菌株的筛选

从红腐乳中分离筛选到一株相对高产γ-氨基丁酸(GABA)的红曲霉菌株M-6,初步鉴定该菌株为紫红曲霉(Monascus purpureus).对菌株M-6的发酵培养基和发酵条件用单因素轮换试验和正交试验进行了整体优化.结果表明,菌株M-6转化富集GABA的适宜条件为:以可溶性淀粉为碳源、牛肉膏和硝酸钠为复合氮源,在初始pH5.0、培养温度40℃、摇床速度120 r/mim条件下发酵培养48 h,发酵液中GABA的产量最高可达7.826 g/L.表明利用红曲霉菌株进行富含GABA食品的生产是可行的.     

基于神经网络与遗传算法优化γ-氨基丁酸的发酵条件

本文运用BP(back-propagatfon)神经网络优化红曲霉ZL307产γ-氨基丁酸的固态发酵工艺条件,建立了发酵条件与γ-氨基丁酸产量的关系模型,采用遗传算法对此模型进行全局寻优.神经网络结构为4-11-1的模型能较为精确地拟合输入的样本数据,测试样本的输出值与试验结果的相关系数为0.989.遗传算法优化出的最佳工艺参数为温度31.7℃、初始pH 4.6、初始含水量69.8%,接种量13.2%.在优化条件下,γ-氨基丁酸产量为0.518mg/g,含量比优化前提高了19.6%.     

微生物发酵法合成高分子聚合物γ-PGA的研究

以一株γ-聚谷氨酸高产菌枯草芽孢杆菌B-115为实验菌株,分别考察碳源、氮源种类及浓度、前体物添加量、生长因子和发酵条件对γ-聚谷氨酸产率的影响.优化结果显示:碳源是6.5%的玉米糖化液,氮源是0.4%的普通蛋白胨,前体物谷氨酸钠的添加量为4%,生长因子种类及添加量分别为0.15%硫酸镁、0.006%硫酸锰、0.8%磷酸二氢钾、1.0%氯化钠、0.03%氯化钙;发酵条件为初始pH值6.5,接种量2%,装液量50 mL/250 mL1,50 r/min3,7℃培养84 h;γ-聚谷氨酸的产率可从57.85 g/L提高到68.30 g/L.     

(+)γ-内酰胺酶研究进展

(+)γ-内酰胺酶能够拆分(+/-)γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺,(-)γ-内酰胺可用于合成心血管扩张剂和抗病毒药物如阿巴卡韦和帕拉米韦。目前只有几种产(+)γ-内酰胺酶的微生物被报道,它们所产的(+)γ-内酰胺酶基因也都被克隆表达了。(+)γ-内酰胺酶基因具有多样性,(+)γ-内酰胺酶的作用机理还有待于进一步研究。     

枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的发酵条件优化分析

为获得枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的最佳发酵条件,分别对碳源、氮源、碳氮质量比、发酵时间和培养温度进行了单因素实验,在此基础上对发酵温度、接种量、培养基初始pH值和发酵时间四因素进行了L9(34)正交优化试验.结果表明枯草芽孢杆菌分泌β-甘露聚糖酶的最佳碳源为40 g/L魔芋精粉,最佳氮源为5 g/L酵母抽提物,两者最佳质量比为5∶1,最佳发酵条件为30℃的条件下摇瓶培养28 h;最佳发酵参数组合为发酵温度30℃、接种量5%、培养基初始pH6.5、发酵时间28 h;各因素对枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的影响程度大小依次为发酵时间>发酵温度>接种量>培养基初始pH,其中发酵时间对产酶的影响最为显著.     

γ-聚谷氨酸高产菌株的选育及发酵条件优化

以聚谷氨酸(γ-PGA)产生菌Bacillus subtilisHD-23为出发菌株,采用紫外线-硫酸二乙酯-亚硝基胍三因素的多组复合诱变,获得菌株Bacillus subtilisHD-F9,γ-PGA产率达到10.72 g/L,提高了56.3%,且传代稳定.对菌株Bacillus subtilisHD-F9的发酵培养基配比进行正交设计优化,并对其摇瓶培养条件进行优化,得到最佳发酵条件为:葡萄糖50 g/L,酵母膏8 g/L,谷氨酸钠40 g/L,250 mL三角瓶装液40 mL,初始pH 7.5,37℃,200 r/min,振荡培养48 h,γ-PGA产量可达14.88 g/L,提高38.8%.     

高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株筛选及发酵条件优化

从实验室保藏的11种红曲霉中,筛选出高产γ-氨基丁酸的红曲霉CH-1菌株.研究了发酵温度、时间、接种量、谷氨酸钠添加量等发酵条件对红曲霉CH-1产GABA含量的影响.经单因素实验及正交试验后得出红曲霉CH-1发酵大米产γ-氨基丁酸的较佳发酵条件为：发酵温度30℃,发酵时间9 d,接种量17%,谷氨酸钠添加量0.10 g,在此条件下,红曲霉CH-1发酵大米产GABA为1.93 mg/g,经高效液相色谱检测,桔霉素含量为0.01μg/g,低于国家标准1μg/g,可利用该产品开发更多形式的红曲食品.     

摇瓶中重组大肠杆菌生产人γ-干扰素工艺优化

目的优化大肠杆菌生产重组人γ-干扰素摇瓶发酵工艺条件,分析摇瓶发酵过程中的制约因素。方法在摇瓶中研究了种子菌龄、接种量和诱导时机等因素对工程菌生产rhIFN-γ和质粒稳定性的影响,及优化条件下工程菌发酵参数。结果最佳条件:种子液为OD6000.5~1.5,接种量为6%,培养至OD600为1.5时42℃诱导表达4 h。在此条件下,在摇瓶中使用M9II培养基时,质粒无丢失,摇瓶中rhIFN-γ的表达量占菌体总蛋白的43.2%,光密度为3.3。对发酵过程中总糖、还原糖、总氮和pH的分析表明,发酵过程中培养基中碳源、氮源丰富,而溶解氧的不足和pH值偏酸性可能是整个培养过程的限制性因素。结论构建的工程菌发酵的稳定性和重复性良好,为rhIFN-γ的大规模生产提供可靠的放大依据。     

超声波在γ-聚谷氨酸发酵工艺中的应用

考察了枯草杆菌液体发酵过程中施加超声波刺激对γ-聚谷氨酸合成的影响,并对超声波辅助水提法提取固体基质中γ-聚谷氨酸的效果进行了研究。结果表明,超声波在适当条件下刺激枯草杆菌,对其液体发酵合成γ-聚谷氨酸有明显促进作用。当枯草杆菌培养12 h后,在37℃、50W超声功率下连续辐照1 h,γ-聚谷氨酸产量提高了24.76%。超声波辅助提取γ-聚谷氨酸的提取率比常规工艺提高30%以上。优化的超声提取工艺条件为:超声波功率40 W,温度为70℃下浸提30 min。     

高温产氢菌的分离及其发酵木糖产氢特性研究

利用改进的Hungate厌氧技术从堆肥中分离出一株能有效利用木糖发酵产氢的高温菌D22.菌株D22革兰氏染色为阴性、显运动性、产芽孢,有鞭毛.其生长的温度范围是30～71 ℃,最适温度为59 ～61 ℃,耐受pH值范围是4.5～8.0,最适pH值范围是6.5～7.0.菌株D22可以利用淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖、绵子糖、CMC、七叶苷、半乳糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、糖原、甘露糖、赤薛糖醇、菊糖等碳源生长并发酵产氢.有机氮源不是其必需的生长因子.D22发酵木糖的终产物为H2、CO2、乙酸和乙醇.系统发育树分析表明菌株D22与Thermoanaerobacterium saccharolyticum相似性最高达98.4%,生理生化特征表明菌株D22应是Thermoanaerobacterium属的一个新菌株.以木糖为碳源时,最佳生长产气碳源浓度是50 mmol/L.在60 ℃,初始pH值为7.0条件下,其氢气的转化率可以达到1.44 mol H2/(mol木糖),最大产氢速率为16.42 mmol H2/(gDW·h-1).     

双醛γ-环糊精的制备工艺研究

根据Malaprade反应的原理,采用高碘酸盐氧化γ-环糊精的方法制备双醛γ-环糊精,探讨了p H值、高碘酸钠与γ-环糊精摩尔比、反应温度、反应时间对双醛γ-环糊精中醛基含量的影响.结果显示,在高碘酸钠与γ-环糊精的摩尔比为1、p H值为2、反应时间3 h、反应温度在30~35℃之间的条件下,采用将高碘酸钠固体溶解后投入到γ-环糊精溶液中的方法投料,可得到双醛γ-环糊精.     

γ-聚谷氨酸的絮凝活性研究

利用枯草芽孢杆菌通过发酵生产得到γ-聚谷氨酸,再经过提取纯化得到纯品.γ-聚谷氨酸作为一种新型的微生物絮凝剂,具有用量少、无污染等优点.通过研究表明,最佳絮凝介质为1g/L的高岭土溶液,γ-聚谷氨酸的浓度为0.2 g/L时絮凝活性最好,最佳絮凝条件为自然pH值和室温,最佳的助凝离子是Cu2+,当Cu2+的浓度为0.2 mol/L时助凝效果最好,此外γ-PGA比聚丙烯酰胺具有更好的絮凝活性,对花园土的絮凝率能达到32.1%.     

γ-聚谷氨酸降解影响因素及其生物降解性能的研究

为开发制备低相对分子质量γ-聚谷氨酸的最佳方法，在不同温度、pH值条件下水解γ-聚谷氨酸，利用凝肢色谱法测定不同水解时间的相对分子质量，实验表明：高温和偏酸或偏碱环境均有利于γ-聚谷氨酸的降解，最优的降解条件为低pH的酸性环境下高温加热；采用TOC法研究γ-聚谷氨酸的生物降解性能，其10d降解率在30％以上，28 d降解率在70％以上，参照OECD 301标准，属于易生物降解高分子聚合物。     

γ-聚谷氨酸阻垢性能的研究

通过枯草芽孢杆菌发酵得到γ-聚谷氨酸(γ-PGA),并采用静态阻垢法评价γ-PGA的阻垢性能.研究了温度、pH值、Ca~(2+)浓度、γ-PGA分子量以及γ-PGA浓度对于该阻垢性能的影响,并对其阻垢产物进行结构表征以及对阻垢原理进行初步分析.研究结果表明,γ-PGA大分子和小分子均具有较强的阻垢作用,而小分子具有比大分子更加优良的阻垢特性.在阻CaSO_4垢和阻CaCO_3垢实验中,达到100%阻垢率时,小分子γ-PGA的最低浓度分别为4 mg/L和2 mg/L,而在相同条件下大分子γ-PGA的最低浓度均为20 mg/L.     

L-谷氨酸-γ-乙基酯的微波合成方法研究及分析

对L-谷氨酸-γ-乙基酯的微波合成方法进行研究,采用HPLC法进行分析测定.实验表明,不同的微波辐射时间、温度及催化剂用量对合成反应的影响较大.经试验得到最佳的反应条件:微波辐射温度45℃,微波辐射时间为30 min,催化剂用量为1.1 mL,其产率可达80%以上.实验结果说明,微波技术可用于L-谷氨酸-γ-乙基酯的合成,方法操作简便、反应时间短、产率高,具有一定的实用价值.     

固定化谷氨酸脱羧酶转化γ-氨基丁酸的研究

研究卡拉胶制备固定化谷氨酸脱羧酶及转化γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件.以本实验室研发的诱导剂对构建的表达谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因工程菌进行诱导,并利用卡拉胶对获得的粗酶液进行包埋制备固定化酶,对影响GAD固定化效果和GABA产量的因素进行研究.最佳固定化条件为卡拉胶浓度1.5%,氯化钾浓度3%,硬化时间2 h;转化GABA的最适条件为反应最适pH为3.8～4.3,最适温度为37℃～43℃,将制得的固定化谷氨酸脱羧酶(IGAD)重复使用7次后,催化活力仍保持在最初值的75%;IGAD在最适底物浓度60 mmol/L下反应时间2 h后谷氨酸转化率达99%,利用IGAD进行连续催化反应,最终GABA摩尔转化率为70.98%,晶体得率为91.90%,晶体纯度94.73%.该法具有较好的操作稳定性和较高的底物转化率,为连续化制备γ-氨基丁酸提供参考.     

γ-多聚谷氨酸产生菌高效诱变育种的研究

设计了几组不同的诱变条件对γ-多聚谷氨酸生产菌Bacillus licheniformis ATCC 9945A进行诱变,诱变后将所有菌株混合,以此未经筛选的混合菌共同发酵,并以终产量为指标对发酵条件进行连续的定向调控,使发酵条件逐渐向高产正突变株倾斜,产量得以逐步提高．同时在混合茵状态下找到适合高产正突变株的发酵条件,以此发酵条件作为筛选平板,对混合菌分离纯化,选育到γ-PGA高产菌Zγ-29,产量是出发菌株的4．14倍,筛选条件即为该突变株的最佳发酵条件．     

以甘薯为原料发酵生产丙酮-丁醇-乙醇的研究

【目的】研究以甘薯为原料发酵生产丙酮-丁醇-乙醇(ABE)的可行性。【方法】以本研究分离鉴定的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)J-3-3为生产菌株,通过发酵培养基和发酵条件的优化,确定最佳的发酵工艺条件。发酵产物采用气相色谱的内标法测定。【结果】最佳发酵培养基组成:甘薯液化液初糖浓度为100g/L,豆粕8g/L,KH_2PO_4 0.8g/L,FeSO_4·7H_2O 0.06g/L。最佳发酵条件:温度37℃,初始pH自然(pH值为5.8),种龄22h,接种量10%。在此发酵工艺条件下发酵60h,溶剂产量达到最大,丙酮、乙醇和丁醇的产量分别为6.98g/L、1.16g/L和15.34g/L,总溶剂23.48g/L。【结论】研究结果表明,以甘薯为原料发酵生产丙酮-丁醇-乙醇是可行的,这为拓宽发酵法生产丙酮-丁醇-乙醇的原料来源以及甘薯的深加工提供了新的思路。     

γ-亚麻酸产生菌的低能离子束诱变选育

为了得到γ-亚麻酸(GLA)高产菌株,以深黄被孢霉As3.3410为出发菌株,利用氮离子(N+)注入诱变,并采用马来酰肼抗性筛选和红四氮唑(TTC)法相结合对突变株进行筛选。试验结果表明:当能量为10 ke V时,最佳氮离子诱变剂量为1.56×1015cm-2;当马来酰肼的添加量为40 mg/L时,出发菌株的抑制率为100%;TTC法酶活测定的最佳条件为:温度35℃、p H为8.4、TTC浓度为8 g/L、反应时间为1 h,以此作为摇瓶初筛的条件。经过反复诱变筛选获得一株遗传稳定的高产突变株F312,其γ-亚麻酸产量为1 236 mg/L,比出发菌株(480 mg/L)提高了157.5%。