长链非编码RNA H19、Neat1、Meg3、Gas5在梅山与杜洛克猪卵泡及各组织中的差异表达分析

为探讨lnc RNA在卵泡及组织中的表达规律,采用荧光定量RT-PCR检测lncRNA H19、Neat1、Meg3、Gas5基因在杜洛克与梅山猪各级卵泡和猪不同组织中的表达量变化。结果表明:H19基因在杜洛克猪各级卵泡S、M1、M2、L中的表达量分别是梅山猪的3.61、0.57、4.19、3.27倍,各级卵泡品种间差异极显著(P0.01);Neat1基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的3.94、1.16、1.63、1.44倍,其中S卵泡品种间差异极显著(P0.01);Meg3基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的2.78、1.12、10.65、1.41倍,S、M2卵泡品种间差异极显著(P0.01);Gas5基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的4.53、1.40、6.31、1.14倍,S、M2卵泡品种间差异极显著(P0.01),M1卵泡中差异显著(P0.05)。组织表达分析结果表明,各基因在下丘脑、垂体、子宫、卵巢等组织中均有表达。此研究表明,4个lnc RNA基因在杜洛克和梅山猪中表达量存在较大差异,可能影响卵泡的增殖、发育和成熟。     

杜洛克与梅山猪卵泡中Grb14、eIF4E和SNRPE基因的差异表达研究

为了探讨梅山与杜洛克母猪卵泡中差异表达基因对猪排卵与繁殖性状的影响,对在前期试验中通过消减杂交技术得到的EST杜大5、杜大46、杜大35进行了分析。序列分析结果表明,EST杜大5、杜大46、杜大35分别代表了Grb14、SNRPE、eIF4E基因。组织表达谱分析结果表明,这些EST在各个组织中均有不同程度的表达,其中Grb14基因只在肝脏、肾脏和卵巢、输卵管、黄体、垂体等繁殖相关器官高表达。荧光定量分析结果表明,这些基因在杜洛克猪大卵泡中的表达量均高于在梅山猪大卵泡中的表达量,其中SNRPE、eIF4E基因达到显著水平,在两猪种其他各级别卵泡中也有不同程度的表达差异,其中Grb14在杜M2中的表达量达到梅M2的2.13倍,差异显著,eIF4E基因在杜M1的表达量是梅M1的0.46倍,差异极显著。在猪种内大卵泡L、中等卵泡M2、中等卵泡M1、小卵泡S的相对表达量也有不同程度的差异。这些差异表达的基因可能影响卵泡发育和成熟,为深入了解这些基因在卵泡发育中的作用奠定了基础。     

miR-23b对口腔癌转移影响

口腔癌转移是威胁全世界生命健康的问题,有效的靶向治疗对口腔癌患者尤为重要.近年来,microRNA(miRNA)作为一种微小的非编码RNA在肿瘤转移中发挥着重要的作用,因此,开展了体外探究miR-23b在口腔癌转移中的作用.利用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qRT-PCR)检测了miR-23b在口腔正常细胞和口腔癌细胞中的表达差异,结果显示miR-23b在口腔癌细胞中的表达明显高于口腔正常细胞中的表达,且随着口腔癌转移程度的增加而增高(P0.05).在此基础上,通过给细胞转染miR-23b mimics的方法过表达miR-23b,以探究该miRNA对口腔癌转移的作用.实验结果发现,增加口腔原位癌细胞Um-2中miR-23b的表达后,该细胞的转移能力显著增强,表明miR-23b在口腔癌转移中发挥着重要作用,可能成为临床口腔癌的治疗靶点和口腔癌检测标志物.     

miR-429对甲状腺癌细胞增殖迁移侵袭能力的影响

目的 探讨miR-429对甲状腺癌细胞增殖迁移能力的影响及其作用机制.方法 将甲状腺癌细胞分为观察组(anti-miR-429质粒转染)、阴性对照组(miR-429空载体质粒转染)、空白对照组(不进行转染),分别进行CCK-8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验.RT-PCR法检测miR-429表达水平,Western blot法检测MMP-2、MMP-9、P21、CyclinD1蛋白表达水平.结果 转染48 h后,观察组SW579细胞中miR-429表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).SW579细胞培养12、24 h时,增殖水平在三组间比较差异无统计学意义(P>0.05);SW579细胞培养48、72 h时,观察组明显高于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05).观察组迁移细胞数和侵袭细胞数均明显多于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).观察组MMP-2、MMP-9、P21、CyclinD1蛋白相对表达量明显高于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 miR-429在甲状腺癌中是一种抑癌基因,能够有效抑制甲状腺癌细胞的增殖和分化,可能是通过MMP-2、MMP-9、P21、CyclinD1蛋白而发挥抑癌基因的作用.     

杜洛克与梅山猪大卵泡消减文库的构建

为了鉴定杜洛克猪相对于梅山猪在大卵泡中高表达的基因,本研究应用抑制性消减杂交技术成功构建了以梅山大卵泡c DNA为driver,杜洛克大卵泡c DNA为tester的消减c DNA文库。结果显示:以G3PDH和β-actin为指标检测文库的消减效率为25,从该文库中获取了350个有效的阳性克隆,PCR检测插入片段主要分布在150-750 bp。克隆测序得到74个有效的EST序列,GO分析表明主要与细胞信号、细胞结构、代谢、细胞分化、基因/蛋白质合成、细胞组织防护等功能相关。利用q PCR技术验证了ELTD1、Grb14、SNRPE、CSDE1、ALDH18A1、e IF4E、BMPR-IB等基因在梅山和杜洛克大卵泡中的表达模式。结果发现在两猪种的大卵泡间存在显著性差异。本研究有助于揭示影响猪卵泡发育和生殖数量控制的分子基础。     

MiR-199b-3p、miR-373、miR-548c-3p及Lin28在肺癌中表达及其意义

探讨miR-199b-3p、miR-373、miR-548c-3p与Lin28在肺癌中的表达,以及它们与临床指标的相关关系.用溶液法提取46例肺癌患者的癌组织和癌旁组织中的总RNA,Q-PCR检测基因的相对表达量.经过两独立样本t检验,比较miR-373(t=3.28,P=0.000 7)、lin28(t=3.94,P=0.001 6)及miR-548c-3p(t=2.98,P=0.002)在肺癌组织和癌旁组织中的表达,基因表达均有显著性差异.使用Spearman肺癌组织中RNA与免疫组织化学指标发现MiR-b199b-3p与MRP(Rs=0.40,P=0.029),miR-548c-3p和Ki167呈正相关关系(Rs=0.52,P=0.0056),miR-373与K167呈正相关关系(Rs=0.43,P=0.029),Lin28与P53呈负相关关系(Rs=-0.43,P=0.022),还与PGP呈负相关关系(Rs=-0.38,P=0.034).miR-373在肺癌患者组织中基因表达显著下调,而miR-548c-3p与Lin28基因表达呈上调,3个基因的表达与肿瘤的发生发展关系密切.     

miR-22在急性Stanford A型主动脉夹层患者中的表达

目的 探讨miR-22在急性Stanford A型主动脉夹层患者中的表达.方法 选取急性Stanford A型主动脉夹层患者26例为研究组,瓣膜性心脏病患者26例为对照组.采集两组患者空腹外周静脉血5 mL,术中采集边长约0.5 cm的主动脉壁组织标本.应用RT-PCR法检测血清和主动脉壁组织中miR-22、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-1、Caspase-3的mRNA表达水平;应用Western blot法检测主动脉壁组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的蛋白表达水平;应用Elisa法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、IL-18、核因子κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶16(MMP-16)的浓度.结果 研究组患者突发性撕裂样胸痛、心功能分级Ⅲ～Ⅳ级、冠状动脉受累、重度主动脉瓣关闭不全的患者比例明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).研究组患者外周血血清及主动脉组织中miR-22表达水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).研究组患者主动脉组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).研究组患者外周血IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、NF-κB、MMP-16水平均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 miR-22在急性Stanford A型主动脉夹层患者中表达水平升高,可通过NLRP3基因靶向诱发Caspase-1、Caspase-3活化和炎症因子的高表达.     

家族性和三阴性乳腺癌血清中miR-21的表达

目的:检测血清miR-21在乳腺癌中的表达差异,为进一步阐明miR-21在家族性和三阴性乳腺癌发病机制中的作用.方法:收集健康女性体检者、具有患乳腺癌高风险者、不同种类乳腺癌患者的血清.以线虫miR-39为外参,通过实时荧光定量PCR检测77份血清中miR-21的表达水平.结果:家族性乳腺癌组、三阴性乳腺癌组和乳腺癌高风险组血清miR-21水平显著高于正常对照组、其他乳腺癌组(P0.01).血清miR-21的表达水平与淋巴结转移、Ki67高表达有关(P0.01).结果显示血清miR-21表达量在家族性和三阴性乳腺癌中升高,且与淋巴结转移和Ki67表达有关.结论:血清miR-21与三阴性、家族性乳腺癌的发生有紧密联系,其表达增高与乳腺癌的遗传性、恶性程度及预后判断有关.     

miR-106b/miR-93降低了宫颈癌细胞对顺铂化疗的敏感性

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科癌症.顺铂是临床上最常用的化疗药物,治疗过程中引起的顺铂抗性会导致化疗失败.越来越多的报道证实miRNA介导了癌症对化疗药物的敏感性.尽管已经发现miR-106b/miR-93促进多种癌症的发生发展,但是miR-106b/miR-93在宫颈癌中的功能鲜为人知.本研究发现miR-106b/miR-93在宫颈癌组织以及宫颈癌细胞系的表达高于正常宫颈组织.在HPV(+)宫颈癌细胞系中,miR-106b/miR-93的表达水平与细胞系对顺铂敏感性的程度相关;高表达miR-106b/miR-93可以降低宫颈癌细胞系对顺铂的敏感性;反之,miR-106b/miR-93的干扰表达可以提高宫颈癌细胞系对顺铂的敏感性.此外,我们发现RAD1是miR-106b/miR-93共同调控的靶基因.研究结果提示了miR-106b/miR-93通过负调控RAD1降低了宫颈癌对顺铂化疗的敏感性.     

外泌体包裹的miR-19b抑制EV71复制的影响

[目的]探讨外泌体包裹的miR-19b对EV71病毒复制的影响,为EV71病毒的miRNA防治药物的开发提供参考.[方法]将游离的miR-19b-cy3.5分子和转染miR-19b-cy3.5的HT29细胞分泌的外泌体分别处理T98G细胞,观察进入细胞的效率;分别提取未处理的、转染mimic-n.c.和转染miR-19b的HT29细胞分泌的外泌体,并给予T98G细胞孵育后,检测细胞内miR-19b的表达;分别以60 mg/L转染mimic-n.c.的HT29细胞分泌的外泌体、60 mg/L和40 mg/L转染miR-19b的HT29细胞分泌的外泌体孵育T98G细胞并感染EV71病毒,检测病毒RNA载量;将携带包裹的miR-19b-cy3.5的HT29细胞来源的外泌体,通过尾静脉注射小鼠检测miR-19b在小鼠各个器官中的表达.[结果] miR-19b-cy3.5能够通过外泌体的形式进入T98G细胞中,而游离的miR-19b-cy3.5无法进入细胞;转染miR-19b的HT29细胞分泌的外泌体在处理T98G细胞后,胞内miR-19b高表达,同时,外泌体处理后的T98G细胞中EV71病毒R...     

Clinical and pathological features of miR-10b and RHOC gene expression in hepatocellular carcinoma

Aberrant expression of microRNAs （miRNAs） was reported frequently in different human cancers. The major role of miRNA is targeting 31-UTR of coding gene and causing translational repression or mRNA degradation. miR-10b overexpression was reported to promote breast cancer metastasis by up-regulating RHOC expression. But its expression in hepatocellular carcinoma （HCC） remains unclear. Our study indicated that the expression of miR-10b was different in HCC and adjacent tissue samples, and reduced expression of miR-10b in HCC was related tovein invasion. High-level expression of RHOC was also related to vein invasion in HCC. But no correlation was found between miR-10b and RHOC expression. These results suggest that miR-10b and RHOC are independent predictors of HCC invasion and metastasis.     

血清miR-25、miR-223和miR-373作为食管鳞癌生物标志物的评价

为了探讨血清miRNA作为诊断标志物的可行性,利用茎环引物进行qRT-PCR,检测了miR-25、miR-223和miR-373在正常人血清、食管鳞癌患者术前和术后第7 d血清、癌组织和癌旁组织的相对表达量.实验结果表明:术前食管鳞癌病人的3种血清miRNA相对表达量高于正常人和手术后第7 d病人,AUC分别为0.794、0.839和0.873,癌组织的这3种miRNA相对表达量高于癌旁组织.这3种miRNA在食管癌患者癌组织的高表达导致血清的这3种miRNA含量增高,因此这3种血清miRNA可以作为候选诊断标志物.     

Amplification of the miR-181c/d cluster is inversely correlated with PDCD4 expression in gastric cancer

miR-181c/d is dysregulated in gastric cancer （GC）. We investigated the amplification and expression of miR-181c/d and its predicted target genes in GC. Amplification of miR-181c/d was quantified by genomic real-time PCR in GC and adjacent normal tissues, as well as the levels of mature miR-181c/d was performed by real-time PCR in the same tissues. The potential target genes of miR-181c/d were predicted using bioinformatics software. Expression of one potential target gene, PDCD4, was measured by semiquantitative RT-PCR, real-time PCR, and immunohistochemistry. Next, the relationship between miR181c/d expression and PDCD4 expression was analyzed. Results indicated that the amplification and expression of miR-181 c/d were significantly higher in GC than in adjacent normal tissues （primary miR-181 c/d, P 〈 0.001; miR-181 c,P = 0.0344; miR-18 ld, P = 0.0153）, and there was a strong correlation between mature miR-181c/d and primary miR-181c/d. Thirty-two target genes were predicted, including PDCD4 which is a known tumor suppressor gene. Expression of PDCD4 was significantly down-regulated in GC as compared to adjacent normal tissues and was inversely correlated with miR-181c/d expression in GC （miR-18lc and PDCD4： R = -0.496, P = 0.008; miR-181d and PDCD4： R = -0.454, P = 0.003）. Therefore, miR-181c/d may play a pivotal role in the pathogenesis of GC by down- regulating PDCD4 expression.     

Study on pig growth hormone gene polymorphisms in western meat-type breeds and Chinese local breeds

Chinese Meishan and Jiangquhai pigs are two of the most prolific pigs in the world, but their growth rate is lower than that of Duroc, Landrace and Pietrain pigs. It is suggested that growth rate is regulated by growth hormone. The objective of the current study was to analyze the porcine growth hormone (pGH) gene polymorphisms based on the polymerase chain reaction restriction fragment-length polymorphism method (PCR-RFLP) for three western meat-type breeds (Duroc, Landrace and Pietrain) and two local Chinese pigs (Meishan and Jiangquhai). Five polymorphic restriction sites were detected with the ApaI, MspI, BspI and HhaI restriction enzymes in two amplified fragments (605 bp, -119 to +486; 506 bp, +206 to +711). Breed difference was found only in the 506 bp fragment. There was no difference in allelic frequencies of BspI and HhaI restriction sites among the five breeds (P>0.05). Landrace and Meishan pigs lacked allele G3 of MspI site. The allele G3 frequency of restriction MspI site of the 506 bp fragment in Pietrain pigs was higher than that in Duroc and Jianquhai pigs (P<0.001). For ApaI site, the Meishan pigs lacked allele G1; no difference was found in allelic frequencies among Pietrain, Duroc, Landrace and Jiangquhai pigs (P>0.05). This new and rapid PCR-RFLP typing method is an attractive tool for analysis of porcine growth hormone gene restriction sites. The differences in MspI and ApaI restriction sites may explain the growth difference between the foreign meat-type breeds above mentioned and local Chinese pigs.     

miR-143-3p通过调节TGIF2的表达在甲状腺癌中的作用研究

目的 探究过表达 miR-143-3p 对甲状腺癌( thyroid cancer,TC) 细胞的影响及其作用机制。 方法 Real-time PCR 分析正常甲状腺上皮细胞和不同 TC 细胞中 miR-143-3p 的表达。 Targetscan 网站和双荧光素酶报告系统验证miR-143-3p 和 TGIF2 3′UTR 的靶向关系;Real-time PCR 检测 miR-143-3p 和 TGIF2 mRNA 的过表达效率;过表达成功后,将 CAL-62 细胞分为对照组、miR-143-3p mimic 组、pcDNA-TGIF2 组和 miR-143-3p+TGIF2 组,ELISA 检测细胞上清液中诱导型一氧化氮合酶( iNOS) 、白细胞介素( IL) -1β 和 IL-6 的含量;试剂盒检测超氧化物歧化酶( SOD) 水平,免疫荧光检测活性氧( ROS)产生;显微观察干细胞成球,Western blot 检测 TGIF2、p-P65、富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体5 ( LGR5) 和 八聚体结合蛋白4 ( OCT4 ) 蛋 白 表 达。体内构建裸鼠移植瘤, 检测过表达miR-143-3p 对肿瘤生长的影响。 结果 miR-143-3p 在 TC 细胞中的表达明显低于正常甲状腺上皮细胞( P< 0. 05) 。Targetscan 网站和双荧光素酶报告系统证实 miR-143-3p 与 TGIF2 存在靶向关系。 miR-143-3p mimic 组 miR-143-3p的表达上调( P<0. 05) ,TGIF2 mRNA 和蛋白表达下调( P<0. 05) ,iNOS、IL-1β 和 IL-6 含量明显降低( P<0. 05) ,抗氧化能力显著下降 ( P < 0. 05) , 干 细 胞 成 球 能 力 降 低 ( P < 0. 05) , p-P65、 LGR5 和 OCT4 的蛋白表达均显著下调( P<0. 05) 。 pcDNA-TGIF2 组的结果相反,过表达 miR-143-3p 能显著抑制 pcDNA-TGIF2 的促癌作用。 裸鼠移植瘤模型表明过表达 miR-143-3p 能够减小肿瘤的质量和体积,下调瘤组织中 TGIF2 和 OCT4 的表达( P<0. 05) 。 结论过表达 miR-143-3p 能够通过下调 TGIF2 的表达抑制 TC 细胞促炎因子水平、抗氧化能力和干细胞样特性,并抑制裸鼠肿瘤的形成。     

miR-430基因簇的生物信息学分析

很多microRNA （miRNA）基因在基因组上紧密排列形成miRNA基因簇,mir-430是目前已发现的最大miR-NA基因簇,但其起源和进化方面却是未知的.为了揭示mir-430基因簇的起源及其在相关物种的进化关系,文中基于miRNA序列同源保守的特点,采用BLAST程序在NCBI基因数据库中搜索mir-430序列,在14个物种中共搜索到35个mir-430基因序列,这14个物种都为硬骨鱼类.多序列对比发现mir-430基因簇成熟序列的第2到第8位碱基以及第16到第22位碱基为保守序列.进化分析表明七鳃鳗的pma-mir-430基因可能是此基因家族最早出现的基因形式,并且pma-mir-430e可能是其他物种mir-430基因的祖先基因.祖先基因经过个别碱基的缺失及突变、串联重复和大片段重复等方式形成了mir-430基因簇.该研究通过分析不同物种中mir-430基因簇的特征,揭示mir-430基因簇的分子进化规律,为其调控网络和功能研究提供理论基础.     

miR-18a对于成肌细胞胶原蛋白表达的影响

细胞外基质是骨骼肌微环境的重要组成,基质中胶原蛋白的过量表达,会导致骨骼肌纤维化,因此研究miR-18a对于成肌细胞胶原蛋白表达的影响具有重要意义。本研究利用实时荧光定量PCR、细胞划痕、组织切片HE染色等方法检测了肌肉损伤修复模型中miR-18a及胶原蛋白基因的表达变化以及在成肌细胞C2C12中过表达miR-18a模拟物后对胶原蛋白基因表达、细胞迁移和成肌细胞转分化的影响。结果表明,miR-18a及胶原蛋白的表达量会响应骨骼肌的损伤修复过程。在成肌细胞中,miR-18a的过表达会抑制胶原蛋白相关基因的表达。但miR-18a的过表达并不影响成肌细胞的迁移和向骨的转分化。因此miR-18a对于细胞外基质相关基因的研究,可以为骨骼肌损伤修复的治疗提供理论依据。     

MicroRNA及其靶基因在糖尿病肾病小鼠肾脏的表达

 验证与糖尿病肾病小鼠肾脏相关的microRNAs的表达并运用实时荧光定量PCR分析靶基因与糖尿病肾病的关系。以db/db小鼠为模型组（DN组）,db/m小鼠为正常组（NC组）,定期测量小鼠的体重、血糖、甘油三酯、总胆固醇及24 h尿蛋白排泄率。留取DN小鼠与NC小鼠肾脏组织,检测肾脏组织形态学染色及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。qRT-PCR验证差异表达的microRNAs及其靶基因的mRNA表达水平。血糖、24 h尿蛋白排泄率结果表明糖尿病肾病动物模型构建成功。与NC小鼠相比,DN小鼠肾脏miR-196a、miR-21、miR-200b表达明显升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。miR-196a、miR-200b、miR-21的表达水平与血糖、甘油三酯、总胆固醇、24 h尿蛋白排泄率存在正相关关系（P<0.05）。利用miRNAs数据库预测miR-196a的靶基因有ANX1、HOXB7、PTEN、FOXO1、HOXB8、HOXA5等。与NC组比较,DN组ANX1、FOXO1的mRNA表达水平降低,且差异有统计学意义（P<0.05）。同时ANX1、FOXO1与24 h尿蛋白排泄率存在正相关（P<0.05）。MiR-196a可能通过调节ANX1、FOXO1的表达水平来参与糖尿病肾病的发生发展。