miR-330调控TAp73α介导的结直肠癌细胞HCT116对顺铂的敏感性

microRNA调控靶向基因的表达,影响其细胞周期进程、凋亡等过程的进行.采用双荧光素酶报告基因的方法,发现miR-330可以降低结合P73-3′UTR的荧光活性,同时在HCT116细胞中,慢病毒过表达miR-330可以抑制内源性TAp73蛋白的表达,在此基础上,用cisplatin处理细胞后,过表达miR-330的细胞加速凋亡,而这一过程在恢复TAp73的表达后,细胞凋亡活动又被减弱.另一方面,包装慢病毒shRNA-P73感染HCT116细胞所引起的生物学效应与miR-330一致.而且这种作用不依赖于p53.所以,在结肠癌细胞HCT116中,过表达miR-330可下调P73的表达并增强细胞对治疗药物顺铂的敏感性,为治疗顺铂抗性的肿瘤细胞提供了一条新途径.     

长链非编码RNA FGD5-AS1 通过 miR-542-3p/GTPBP4对肝癌细胞放射敏感性的影响

目的:探讨长链非编码RNA FGD5-AS1(lncRNA FGD5-AS1)对肝癌细胞放射敏感性的影响及其分子机制.方法:运用qRT-PCR检测FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达情况;采用克隆形成实验和流式细胞仪分析FGD5-AS1和GTPBP4表达变化对肝癌细胞系放射敏感性的影响.利用基因沉默、qRT-PCR和Western blot检测FGD5-AS1对miR-542-3p及其靶基因GTPBP4表达的影响,并运用荧光素酶报告实验分析lncRNA FGD5-AS1对miR-542-3p/GTPBP4表达的调控作用.结果:FGD5-AS1和GTPBP4在肝癌组织和肝癌细胞系中表达上调,miR-542-3p在肝癌组织和肝癌细胞系中表达下调.沉默FGD5-AS1可增强肝癌细胞Huh7和PLC5的放射敏感性.沉默GTPBP4可以抑制Huh7和PLC5细胞的克隆形成,促进Huh7和PLC5细胞的凋亡,增强Huh7和PLC5细胞的放射敏感性.GTPBP4是miR-542-3p的下游靶基因,miR-542-3p可以负向调控GTPBP4的表达水平;而FGD5-AS1可负向调控miR-542-3p的表达,并正向调控GTPBP4的表达水平;FGD5-AS1对HCC细胞放射敏感性的影响又依赖于miR-542-3p.结论:FGD5-AS1作为miR-542-3p的"分子海绵"竞争性上调GTPBP4的表达进而影响肝癌细胞的放射敏感性.     

miR-503下调Bcl-2增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

目的:探讨miR-503通过调控Bcl-2的表达介导肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU对5-氟尿嘧啶敏感性的影响.方法:microRNA(miRNA)芯片筛选BEL-7402与BEL-7402/5-FU细胞中表达差异的miR-503为候选的miRNA;脂质体转染法将miR-503模拟物瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测BEL-7402/5-FU及其亲本细胞中miR-503、Bcl-2 mRNA的表达水平;Western Blot观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达水平;CCK-8法检测细胞药物敏感性的改变.结果:相比于BEL-7402细胞,miR-503在BEL-7402/5-FU细胞中表达水平下调,而Bcl-2蛋白的表达水平上调;miR-503过表达后BEL-7402/5-FU细胞中的Bcl-2在mRNA和蛋白水平上表达降低;miR-503转染组的BEL-7402/5-FU细胞活力较miRNA阴性对照组显著降低.结论:miR-503可能通过下调Bcl-2的表达,进而增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性,抑制细胞增殖.     

A549／CDDP多药耐药细胞系的建立

以顺铂(CDDP)为诱导物,采用间歇逐步增加剂量法建立了人肺腺癌多药耐药细胞系A549/CDDP;MTT法测定A549/CDDP对顺铂、丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶、长春新碱、表阿霉素及紫杉醇等的耐药指数.A549/CDDP细胞较亲本细胞略小,核质比增加,倍增时间没有明显变化;MTT法测定A549/CDDP的药物敏感性,对顺铂的耐药指数是20.29,对丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶、长春新碱、表阿霉素及紫杉醇等药物有不同程度的耐药性,但对卡氮芥和羟基喜树碱无耐药性;A549/CDDP对顺铂的敏感性降低,其顺铂的含量较亲本细胞下降.     

长链非编码RNA LINC00478抑制微小RNA-214对口腔鳞癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨长链非编码RNA LINC00478对口腔鳞癌细胞顺铂耐药性的影响及其对微小RNA-214(miR-214)的靶向调控作用.方法:采用qRT-PCR法检测口腔鳞癌组织、癌旁组织中LINC00478、miR-214的表达量;体外培养口腔鳞癌细胞CAL-27,建立顺铂耐药性细胞CAL-27/DDP,分别将pcDNA、pcDNA-LINC00478、pcDNA-LINC00478与miR-NC、pcDNA-LINC00478与miR-214 mimics转染至CAL-27/DDP细胞;采用qRT-PCR法检测CAL-27细胞与CAL-27/DDP细胞中LINC00478、miR-214的表达量;MTT法与克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验检测LINC00478、miR-214的靶向关系;Western blot法检测Ki67、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3蛋白表达量.结果:与癌旁组织比较,口腔鳞癌组织LINC00478的表达水平显著降低(P0.05),miR-214的表达水平显著升高(P0.05);与CAL-27组比较,CAL-27/DDP组LINC00478的表达水平显著降低(P0.05),miR-214的表达水平显著升高(P0.05);与转染pcDNA比较,CAL-27/DDP细胞中转染pcDNA-LINC00478可提高增殖抑制率、凋亡率及Cleaved-caspase3蛋白水平(P0.05),减少克隆形成数(P0.05),降低Ki67、Pro-caspase3蛋白水平(P0.05);双荧光素酶报告实验证实LINC00478能够靶向调控miR-214的表达及活性;与共转染pcDNA-LINC00478与miR-NC比较,共转染pcDNA-LINC00478与miR-214 mimics可降低增殖抑制率、凋亡率及Cleaved-caspase3蛋白水平(P0.05),增加克隆形成数(P0.05),提高Ki67、Pro-caspase3蛋白水平(P0.05).结论:LINC00478通过靶向抑制miR-214的表达而抑制口腔鳞癌细胞增殖及诱导细胞凋亡,从而降低细胞顺铂耐药性.     

AKR1家族基因AKR1C1,AKR1C3,AKR1B1调控肺腺癌A549细胞顺铂耐药的研究

探究醛酮还原酶家族1(Aldo-Keto Reductases family 1,AKR1)3个基因AKR1C1,AKR1C3,AKR1B1调控肺腺癌A549细胞顺铂耐药的作用。通过对肺腺癌A549细胞及相应的顺铂耐药细胞A549/DDP的差异表达基因谱进行分析,发现AKR1家族的3个成员AKR1C1,AKR1C3及AKR1B1同时在A549/DDP细胞中显著上调。在细胞水平上对这3个基因进行了RNA定量实验,抑制剂实验和RNA干扰实验,观察其是否参与调控A549/DDP对顺铂的药物敏感性。研究结果证实:AKR1C1或AKR1B1酶活抑制剂与顺铂联合使用可显著提高A549/DDP细胞的顺铂敏感性,而抑制AKR1C3酶活性并不能引起A549/DDP对顺铂的敏感性增强;此外,基于RNA干扰技术,在A549/DDP细胞中同时敲减AKR1C1和AKR1B1不仅增强了顺铂的细胞毒性,且同时显著增强了顺铂诱导的细胞凋亡作用。以上结果表明,AKR1家族中的AKR1C1和AKR1B1基因在调节A549细胞顺铂耐药中起到了关键的作用。     

周剂量顺铂和奈达铂同步放疗治疗中晚期宫颈癌72例临床分析

目的评价三维适形放疗同步顺铂或奈达铂治疗中晚期宫颈癌患者的近期疗效及不良反应.方法随机将收治的72例组织学明确的中晚期宫颈癌患者分为两组,分别采用顺铂30 mg/m2每周1次或奈达铂30 mg/m2每周1次,两组放疗开始即同步化疗,比较两组患者有效率和副反应发生率.结果顺铂组与奈达铂组的有效率分别为91.7%和94.4%,两组比较无统计学意义(P0.05);顺铂组的胃肠毒性发生率高于奈达铂组(27.8%,11.5%,P0.05);顺铂组的Ⅲ/Ⅳ度骨髓抑制发生率低于奈达铂组(19.4%,30.5%,P0.05).结论周剂量顺铂和奈达铂同步放疗治疗中晚期宫颈癌的近期疗效无差异,副反应均可以耐受.     

miR-19b通过激活Akt信号通路保护心肌细胞凋亡

[目的]基于新生大鼠心肌细胞氧糖剥离再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfu-sion, OGD/R)模型,研究miR-19b对心肌细胞凋亡的调控作用,并初步说明其分子机制.[方法]采用酶解法提取新生大鼠心肌细胞,分别转染mi R-19b模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),然后对细胞进行氧糖剥离再灌注处理,模拟心肌缺血再灌注损伤过程.采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿甘(2’-deoxyuridine 5’-triphosphate, dUTP)缺节末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin nick endlabeling, TUNEL)法,检测心肌细胞凋亡.采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡蛋白(Bcl2, Bax和Caspase3)以及下游分子同源磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)和Akt的表达.[结果] TUNEL染色表明, mi R-19b mimics可以明显降低OGD/R模型中凋亡心肌细胞比率,而miR-19b inhibitor作用则相反.蛋白质免疫印迹法检测Bcl2, Bax和Caspase3的表达变化也与TUNEL染色结果一致. mi R-19b mimics可下调PTEN,激活Akt,而miR-19b inhibitor的作用则相反.同时转染miR-19b inhibitor和PTEN-siRNA进行功能逆转实验,发现PTEN-siRNA可以逆转miR-19b inhibitor对细胞凋亡的促进作用.[结论]miR-19b可通过下调PTEN激活Akt信号通路,保护心肌细胞凋亡.     

miR-9-5p靶向调控ZAK对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:阐明miR-9-5p通过靶向调控ZAK表达从而影响结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。方法:通过qPCR、Western blot检测结直肠癌细胞系(HCT116、SW260、HT29及LoVo)及结直肠癌患者组织样本中miR-9-5p表达水平及ZAK的mRNA和蛋白表达水平。生物信息学方法分析miR-9-5p与ZAK结合的靶向序列。双荧光素酶基因报告实验检测miR-9-5p对ZAK的靶向调控关系。脂质体法将miR-9-5p mimic或/和ZAK质粒共转染结直肠癌细胞系HCT116及SW620,通过CCK-8及克隆形成实验观察miR-9-5p/ZAK信号轴对细胞增殖的影响，通过Transwell观察对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:与人正常上皮细胞系相比，在结直肠癌细胞系中ZAK的mRNA及蛋白水平显著上调(P<0.05);在结直肠癌临床组织样本中，ZAK蛋白水平亦显著上调(P<0.05);miR-9-5p的表达水平在癌细胞系及组织样本中下调(P<0.05)。双荧光素酶报道基因实验显示miR-9-5p能显著影响ZAK 3’UTR野生型表达载体的荧光素酶...     

miR-26b和miR-224在梅山与杜洛克猪卵泡中的差异表达分析

为了探讨miRNAs在猪卵泡和繁殖相关组织中的表达,采用荧光定量RT-PCR法和组织表达谱分析法,对miR-26b和miR-224在梅山和杜洛克猪卵泡及其他繁殖相关组织中的表达进行了研究。组织表达谱分析结果表明:miR-26b和miR-224在下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢、子宫角、黄体组织中均有表达。RT-PCR结果表明:miR-26b在L卵泡中的表达量梅山猪是杜洛克猪的2倍(P0.01);而在S卵泡中的表达量杜洛克是梅山猪的10倍(P0.01);两品种在M1和M2卵泡中的表达量差异不显著。miR-224在S卵泡中的表达量杜洛克是梅山的7.79倍(P0.01);而在M2卵泡中表达量梅山是杜洛克的1.84倍(P0.05);两品种在M1和L卵泡中的表达量差异不显著。在猪种内大卵泡L、中等卵泡M2、中等卵泡M1、小卵泡S的相对表达量也有不同程度的差异。此研究表明,miR-26b和miR-224在梅山和杜洛克猪中表达趋势相似,它们的表达差异可能影响卵泡发育和成熟,为深入了解miR-26b和miR-224在卵泡发育中的作用奠定了基础。     

miR-193b通过负向调控MCT7基因的表达抑制人胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭

为探讨miR-193b对人胶质瘤U251细胞的迁移和侵袭能力的影响,利用HiPerFect转染试剂瞬时转染miR-193b模拟物(mimics)上调U251细胞中miR-193b的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率,然后进行细胞划痕实验及侵袭实验,分别检测miR-193b对U251细胞迁移及侵袭能力的影响.结果显示过表达miR-193b可抑制U251细胞迁移和侵袭的能力.应用生物信息学软件预测,提示单羧酸转运蛋白7(MCT7)基因可能是miR-193b的潜在靶基因.进而构建双荧光素酶报告基因系统从转录水平上证明MCT7为miR-193b调控的靶基因;qRT-PCR及蛋白质免疫印记(Western blot)分别在mRNA和蛋白水平上进一步证明MCT7基因的表达受miR-193b的负调控.由此可见,miR-193b很可能通过负向调控MCT7基因的表达来抑制U251细胞的迁移与侵袭.     

调控TAp73α介导的结直肠癌细胞HCT116对顺铂的敏感性

microRNA调控靶向基因的表达,影响其细胞周期进程、凋亡等过程的进行.采用双荧光素酶报告基因的方法, 发现miR 330可以降低结合P73 3′UTR的荧光活性, 同时在HCT116细胞中, 慢病毒过表达miR 330可以抑制内源性TAp73蛋白的表达, 在此基础上, 用cisplatin处理细胞后, 过表达miR 330的细胞加速凋亡, 而这一过程在恢复TAp73的表达后,细胞凋亡活动又被减弱. 另一方面, 包装慢病毒shRNA P73感染HCT116细胞所引起的生物学效应与miR 330一致. 而且这种作用不依赖于p53. 所以, 在结肠癌细胞HCT116中, 过表达miR 330可下调P73的表达并增强细胞对治疗药物顺铂的敏感性, 为治疗顺铂抗性的肿瘤细胞提供了一条新途径.     

miR-1/133基因簇的进化及其调控网络

miR-1/133基因簇在心肌和骨骼肌中特异性表达,对心脏以及骨骼肌的发育及生理病理具有重要作用.该研究采用生物信息学方法,研究了miR-1/133基因簇的进化特征,预测了其靶基因及其调控的生物学过程.利用miRBase数据库对23种不同物种间miR-1/133基因簇的序列、组织方式进行了比较.采用最大似然法构建miR-1/133基因簇的系统进化树,显示该基因簇的进化与物种进化关系有一定差异.利用在线数据库对miR-1/133基因簇上游转录因子及下游靶基因进行预测,并对其进行综合分析,绘制出该基因簇的网络调控图,表明miR-1/133基因簇参与了骨骼肌与心肌发育、胰岛素受体信号通路、经典Wnt信号通路、p53信号通路等体内重要生理过程,为进一步阐明miR-1/133基因簇的生物学功能提供了理论依据.     

色胺酮在食管癌化疗耐药过程中的作用

为研究色胺酮对食管癌化疗药物顺铂耐药性的抑制作用及其作用机制,设计食管癌Eca109细胞及其顺铂耐药株Eca109/cDDP细胞的顺铂及色胺酮不同处理组,根据实验目的选择不同的处理方式.利用实时荧光定量PCR检测Eca109和Eca109/cDDP细胞中多药耐药基因1(MDR1)及谷胱甘肽-巯基-转移酶-pi基因(GST-pi)的mRNA表达水平;免疫印迹和免疫荧光技术检测Eca109细胞和Eca109/cDDP细胞中MDR1和GST-pi蛋白的表达水平;细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK-8)法检测细胞增殖以及基因敲降后的回补效果.结果表明:色胺酮不仅显著抑制了食管癌细胞顺铂耐药株Eca109/cDDP细胞中MDR1基因的表达,而且MDR1和GST-pi蛋白的表达也受到了显著的抑制;色胺酮不但能抑制Eca109细胞的增殖能力,对耐药株Eca109/cDDP细胞增殖也存在抑制作用;色胺酮逆转耐药性的能力依赖于对MDR1和GST-pi的表达抑制.综上分析,色胺酮能够通过抑制MDR1和GST-pi蛋白的表达来逆转食管癌细胞顺铂耐药株的耐药性,是一种潜在的化疗辅助药物.     

miR-23b对口腔癌转移影响

口腔癌转移是威胁全世界生命健康的问题,有效的靶向治疗对口腔癌患者尤为重要.近年来,microRNA(miRNA)作为一种微小的非编码RNA在肿瘤转移中发挥着重要的作用,因此,开展了体外探究miR-23b在口腔癌转移中的作用.利用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qRT-PCR)检测了miR-23b在口腔正常细胞和口腔癌细胞中的表达差异,结果显示miR-23b在口腔癌细胞中的表达明显高于口腔正常细胞中的表达,且随着口腔癌转移程度的增加而增高(P0.05).在此基础上,通过给细胞转染miR-23b mimics的方法过表达miR-23b,以探究该miRNA对口腔癌转移的作用.实验结果发现,增加口腔原位癌细胞Um-2中miR-23b的表达后,该细胞的转移能力显著增强,表明miR-23b在口腔癌转移中发挥着重要作用,可能成为临床口腔癌的治疗靶点和口腔癌检测标志物.     

A549／TaxR多药耐药细胞系的建立

采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合,通过210 d建立了人肺腺癌多药耐药细胞系A549/TaxR.MTT法测定A549/TaxR的药物敏感性,对紫杉醇的耐药指数是24.79,对丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶、长春新碱、表阿霉素、足叶乙甙、顺铂及卡铂等药物有不同程度的耐药性,但对卡氮芥和吉西他滨无耐药性.本研究建立了稳定的人肺腺癌细胞系(A549/TaxR),可用于下游的实验研究.     

乳腺癌中hsa-miR-17-92基因簇及其旁系同源体的共调控作用

hsa-miR-17-92基因簇高度保守,可以作为抑癌基因抑制乳腺癌细胞的增殖.包括2个旁系同源体:miR-106a-363和miR-106b-25基因簇,其序列高度相似,可能通过调控共同靶基因而具有相似的功能.探讨3个基因簇转录的15条microRNA的序列特征,以及共调控靶基因在人类乳腺正常和癌细胞系中的表达;并进一步就显著差异表达基因进行GO和Pathway(KEGG)分析.结果表明,超过75%(178/236)的共调控靶基因表达具有显著差异性,这些基因可能与生物体的细胞代谢、转录后调控、生物合成等多种生物学过程有关,参与细胞周期,癌症等信号通路.分析发现乳腺特异基因PTPN4在乳腺癌中的低表达影响蛋白磷酸化水平和细胞周期,SMAD4、CCND1和E2F1作为与细胞周期相关基因在细胞的G1期起重要作用,它们的低表达阻止细胞从G1期进入S期,从而抑制癌细胞的生长,起到抑癌作用.特别是,一方面基因簇调控CCND1和E2F1使其低表达,另一方面它们作为转录因子结合到基因簇的启动子区诱导基因簇表达,从而形成负反馈调控循环调控下游基因表达.     

miR-17-92和p21对E2F-Rb网络动力学的影响

转录因子E2F对于细胞周期进程具有重要的作用,它调控着细胞的增殖和凋亡。而p21和miR-17-92都是细胞周期进程的有效抑制剂。为了进一步探究p21和miR-17-92对于E2F的调控机制,提出了E2F/Myc/miR-17-92/p21网络模型。通过数值模拟发现miR-17-92、p21可调控E2F的开关转换值和跳跃的幅度,还可以引导细胞进出癌区且miR-17-92和p21的共同调控比起各自调控更有效。这很可能为癌症的治疗提供新思路。     

MiR-17促进胃癌细胞上皮间质转化机制

目的 探讨miR-17调控胃癌细胞上皮间质转化的作用机制.方法 检测胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17的表达水平;分别将miR-17模拟物(抑制物)和TGFBR2过表达载体(siRNA)转染到SGC-7901胃癌细胞中,通过MTT法、流式细胞术、Transwell实验和Western blotting检测细胞增殖、凋亡、侵袭和EMT标志蛋白表达;荧光素酶报告基因分析验证miR-17与TGFBR2的靶向关系.结果 胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17表达上调;过表达miR-17促进SGC-7901细胞增殖、侵袭,抑制凋亡;miR-17靶向TGFBR2的3'UTR;过表达TGFBR2抑制SGC-7901细胞增殖、侵袭,促进凋亡;miR-17通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路促进SGC-7901细胞EMT.结论 miR-17靶向下调TGFBR2表达,激活PTEN/PDK/AKT信号通路,促进SGC-7901细胞EMT.体内研究结果证明miR-17促进肿瘤的生长.因此,miR-17可能是胃癌抗转移治疗的潜在策略.     

miR-34a靶向MMP-13调控大鼠软骨细胞凋亡的机制

目的:探讨调控miR-34a的表达对大鼠软骨细胞凋亡的影响.方法:大鼠关节软骨原代细胞培养,慢病毒转染miR-34a、miR-34a inhibitor分别使大鼠关节软骨细胞miR-34a过表达和抑制表达,另设无关序列对照组,Annexin V/PI双染流式细胞术分析对比各组大鼠软骨细胞凋亡率,通过生物信息学方法预测miR-34a调控软骨细胞凋亡潜在基因靶点,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time-PCR)检测各组软骨细胞miR-34a的表达,检测软骨凋亡相关因子MMP-13、Col2a1的mRNA转录水平;免疫印迹法检测各组的MMP-13、Col2a1、caspase-3的蛋白表达水平.结果:miR-34a过表达后大鼠软骨细胞凋亡增多,抑制miR-34a表达后大鼠软骨细胞凋亡减少,同时miR-34a过表达后caspase-3的表达增高(P0.05),miR-34a过表达后Col2a1在mRNA和蛋白水平表达下降,而MMP-13的表达增加(P0.05).沉默miR-34a的表达后Col2a1在mRNA和蛋白水平表达增加,而MMP-13的表达下降.MMP-13是miR-34a调控大鼠软骨细胞凋亡的潜在靶点.结论:miR-34a的表达调控大鼠软骨细胞凋亡,MMP-13是miR-34a其机制中的潜在靶点.