budC敲除及ldhA过表达对Klebsiella pneumoniae合成D-乳酸的影响

为了提高K. pneumoniae中D-乳酸的合成效率,本文以BUD和LDH为改造目标,扩增丁二醇脱氢酶基因budC,并在其中插入四环素抗性基因tet,构建了基因敲除载体pTBT,转化K. pneumoniae,利用同源重组技术,敲除K. pneumoniae染色体上的budC基因,得到重组菌K. pneumonia B-;在此基础上,构建了表达载体pKP-ldhA,转化K. pneumoniae B-,过量表达乳酸脱氢酶基因ldhA,得到重组菌K. pneumoniae B-L+。摇瓶发酵结果显示,重组菌K. pneumoniae B-L+的丁二醇合成浓度比原始菌降低了90%以上,D-乳酸合成浓度比K. pneumoniae B-和原始菌分别提高了77.1%和41.4%,发酵罐实验D-乳酸产量68.4g/L,转化率0.78,生产强度1.22g/(L·h)。结果表明,敲除budC及过表达ldhA有利于改善克雷伯肺炎杆菌中D-乳酸的合成。     

灯盏花CHI基因的再克隆及其绿色荧光蛋白表达载体构建

根据灯盏花转录组所注释的CHI unigene片段,设计了RACE相关引物,克隆到灯盏花CHI的cDNA全长序列,序列全长717bp,编码238个氨基酸.该氨基酸序列与我们前期所克隆的灯盏花CHI cDNA序列相比,在345、351位点发生了突变,碱基均由C突变为T,两个位点的突变均属于同义突变,编码的氨基酸分别为115、117位异亮氨酸、酪氨酸.同时将CHI基因片段插入到pDM 18-T,构建pDM 18-T-eBCHI中间载体.经测序验证后,根据pBI121-EGFP图谱,设计带有SalI、SpeI酶切位点的引物,以pDM 18-T-eBCHI中间载体为模板,扩增带酶切位点的CHI序列,扩增产物经回收、纯化后与双酶切的pBI121-EGFP链接,构建了重组表达载体pBI121-EGFP-CHI,CHI基因插入植物表达载体pBI121-EGFP的6xHis组氨酸标签与GFP基因间.经SalI、SpeI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,CHI基因已成功地连接到pBI121-EGFP-eBCHI中.采用电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101,用叶盘法转化灯盏花叶片,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和叶绿素荧光成像检测证明,重组基因已成功地转化到灯盏花愈伤组织中.为利用转基因技术研究CHI基因的表达及其亚细胞定位打下基础.     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的衍生质粒pAl32的酶谱及抗性基因定位

从短小芽孢杆菌四环素抗性质粒pCJ3截短的衍生质粒pAL32,经用6种限制酶双酶解试验,根据琼脂糖凝胶电泳带估算各片段的分子量,作出了pAL32的6种限制酶图谱。利用已除去复制功能的金黄色葡萄球菌质粒pUB110与pAL32构建的Km~rTc~r的双抗性重组质粒pSC33为载体,在EcoRV位点克隆的λDNA片段的重组子均为Km~rTc~s。用pUB110与pAL32在PvuⅡ位点连接后的重组质粒也为Km~rTc~s。根据这些重组子四环素抗性的失活,推知pAL32上EcoRV与PvuⅡ切点均位于其四环素抗性基因上。     

甘薯（Ipomoea batatas L.Lam.）基因启动子在根癌农杆菌中 …

作者曾用自行构建的启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４,从甘薯总ＤＮＡ中克隆到了６５个在大肠杆菌中具有启动基因表达功能的ＤＮＡ片段,现研究发现,甘薯基因启动子片段在根癌农杆菌中也具有启动基因转录的功能,其启动功能的大小与启动子片段在大肠杆菌中启动卡那霉素抗性基因表达活性呈正相关,即原来卡那霉素抗性越高的,ＧＵＳ基因的酶活性越高。利用重组子ｐＩＢ２中插入片段所做的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验证实,该ＤＮＡ片段来     

环状芽胞杆菌基因启动子的分离与鉴定

环状芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ酶切后插入到启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１的ＢａｍＨＩ位点，转化大肠杆菌后，在卡那霉素的平板上筛选到５０个抗性菌落。从随机挑取的２９个抗住菌落所分离到的质粒ＤＮＡ经限制酶切和琼脂糖凝胶电泳后表明，各质粒均有ＤＮＡ插入片段，对２９个样品进行卡那霉素抗性试验显示，抗性最高的可超过１０００μｇ／ｍＬ这表明来自环状芽胞杆菌的某些基因启动子能在大肠杆菌中十分有效地启动基因表达，选取两个最大的克隆ＤＮＡ片段ＢＣ３和ＢＣ６作为探针与Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２．总ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，均获得杂交带。斑点杂交结果表明，这两个ＤＮＡ片段来自不同的基因启动子。对ＢＣ６和ＢＣ３分别进行了限制酶谱分析，并绘制了限制酶图。     

水蜜桃E3泛素连接酶PpARI1基因的克隆及表达载体构建

以新鲜水蜜桃为材料,根据NCBI中预测的桃E3泛素连接酶ARI1基因序列设计引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)克隆该序列.利用双酶切定向连接的方法将PpARI1基因开放阅读框(open reading frame, ORF)正向重组到表达载体pCAMBIAy1300的XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,并用热激法转化到农杆菌感受态细胞中.成功克隆出的长度为1 764 bp的PpARI1基因CDS序列,与预测基因序列的一致性高达99.83%.对重组子测序结果表明, PpARI1基因ORF准确插入pCAMBIAy1300载体的启动子和终止子之间,表明载体构建成功. PCR检测结果也表明,该重组载体已成功转入农杆菌中.这为下一步更深入地研究水蜜桃PpARI1基因的功能奠定了实验基础.     

大肠杆菌 aroL 基因敲除及其对莽草酸合成的影响

以E.coli DH5α基因组为模板克隆莽草酸激酶Ⅱ基因(aroL),构建质粒pMD-aroL,经HpaⅠ、BsaBⅠ酶切后插入卡那霉素抗性基因(kan)得pMD-aroL::kan,利用pKD46的λ重组系统,用该质粒上的kan及两端的aroL同源序列替换E.coli Top10F′基因组上的aroL基因,再运用质粒pCP20编码的FLP重组酶消除kan基因.Southern blot证实基因敲除是成功的,测序结果表明kan已经从基因组上消除,摇瓶发酵显示构建的基因工程菌的莽草酸产量是原始菌株的1.57倍.     

毛尖紫萼藓GpPOD基因克隆及其表达载体的构建

本实验室已成功构建毛尖紫萼藓干旱胁迫cDNA文库。从中选取与抗旱相关的过氧化物酶基因,命名为GpPOD。通过RACE技术克隆获得序列全长。采用RT-PCR方法克隆GpPOD基因,连接到pMD-18T simple载体上,构建克隆载体pMD18T-GpPOD,将其插入表达载体PRI101-AN中,构建表达载体PRI101-GpPOD,然后将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中。重组质粒pMD18T-POD、PRI101-POD的DNA测序结果与原序列相似性高达99%,证明GpPOD基因成功连接到pMD-18T simple载体上,并已克隆到表达载体PRI101-AN中;农杆菌转化后的PCR电泳图谱在约581 bp左右得到清晰条带,证明重组质粒PRI101-GpPOD已成功转入农杆菌中。本实验为后续研究GpPOD基因的遗传转化奠定了良好基础。     

瓜氨酸生产相关基因簇在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达

构建1种组成型载体并将载体应用在表达瓜氨酸相关基因簇argCJBDF上。通过去除pXMJ19诱导型启动子上游阻遏蛋白lacI基因的方法,构建组成型质粒pXMJ19-lacI,并将谷氨酸棒杆菌中合成瓜氨酸途径的基因簇argCJBDF克隆到改造过的组成型载体中,实现瓜氨酸合成相关基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌的组成型表达。结果表明:重组菌在30℃摇瓶发酵72 h后,N-乙酰谷氨酸激酶的酶活达到(0.323±0.015)U/mg,瓜氨酸的产量达到4.33 g/L。成功构建的组成型表达载体,实现了外源基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达。     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

用Ti质粒子的双元载体法将抗性基因转入西红柿体细胞

采用Ｔｉ质粒的双元载体法对西红柿的叶片外植体进行遗传转化，经选择培养基的筛选，从抗性愈伤组织细胞中诱导出具有卡那霉素抗性的幼苗，分子杂交证实，卡那霉素抗基因通过根瘤农杆菌的介导，整合到细胞核基因组中，转化子具有较高的新霉素磷移酶活性，说明抗性基因在受体细胞得到表达。     

马尾松银松素合酶基因转化双子叶植物表达载体的构建及鉴定

以马尾松为材料,在获得马尾松银松素合酶基因的基础上,构建了该基因转化双子叶植物的表达载体,该表达载体含有35S启动子和NOS终止子,能启动基因在双子叶植物中高效地表达.设计并合成分别含有Bgl和BstE酶切位点的上下游引物,通过PCR反应扩增出含有该酶切位点的银松素合酶基因cDNA全序列,酶切后连接到pCAMBIA1301植物表达载体上.经PCR鉴定、酶切分析及DNA测序证实cDNA片段大小、序列以及读码框的正确性.最后通过电击将表达载体转化农杆菌LBA4404,为进一步研究银松素合酶基因的功能奠定基础.     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.     

Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础.     

基于博来霉素抗性筛选的核糖体DNA通用基因打靶载体平台的构建

目的:构建一个基于博来霉素筛选的核糖体区基因打靶载体,为后续的基因打靶研究奠定基础.方法:首先选择含有博来霉素(zeocin)抗性的目的片段与载体连接,并进行单酶切及测序鉴定,最终构建基于博来霉素筛选核糖体基因打靶载体平台.结果:构成pUC19-DS1-SV40-Zeocin-polyA-DS2基因打靶载体与预期一致,测序结果与实验设计相同.结论:成功构建了含有抗性基因的pUC19-DS1-SV40-Zeocin-polyA-DS2水牛基因通用打靶载体平台,便于不同外源基因的插入,为转基因动物模型的建立提供了基础工具.     

无HindⅢ位点新霉素磷酸转移酶标记基因的建立

用体内自发突变，卡那霉素抗性筛选和体外限制酶切富集方法消除载体ｐＮＧ３５中新霉素磷酸转移酶基因内的限制酶位点ＨｉｎｄⅢ，除去ＨｉｎｄⅢ位点后的载体ｐＮＧ３５△Ｈ赋予宿主细胞的卡那霉素抗性水平远远高于原载体ｐＮＧ３５。