日本沼虾感光器Gqα基因的扩增及分析

采用分子生物学方法，提取日本沼虾感光器的总RNA，反转录成c DNA。根据Gq蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，通过巢式PCR扩增出日本沼虾感光器Gqα基因的片段，并将该片段克隆到pMD 18-T载体上进行序列测定，结果显示此基因片段由369bp组成。翻译成氨基酸序列（123aa），Blast搜索结果比较该片段氨基酸序列与美洲鲎、美洲龙虾、冈比亚按蚊等6种动物的Gqα氨基酸保守序列具有高度同源性（83.74％～95％），其中与冈比亚按蚊的Gqα氨基酸序列同源性最高（95％）。     

流苏石斛ISSR-PCR反应体系的优化

以流苏石斛为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合流苏石斛ISSR-PCR分析的最佳反应体系.在20μL反应体系中含1×buffer,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 mmol/L dNTP s,1.0μmol/L引物,0.5 UTaqDNA聚合酶,10 ng模板DNA.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸45 s,共35个循环;最后72℃延伸7 min.     

干用辣椒RAPD—PCR反应体系正交优化的研究

以干用辣椒幼苗为材料,研究了干用辣椒RAPD分析过程中的Taq酶、Mg^2＋,dNTPs、引物、模板DNA浓度、退火温度等影响因素,建立适合干用辣椒RAPD反应的PCR体系,即25μL反应体系中含有解体Taq酶1．5U、Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0．6mmol／L、引物0．8μmol／L、模板DNA60ng．扩增程序为：94℃预变性4min;94℃变性1min,37℃退火1min,72％延伸1．5min,40个循环;最后72℃副延伸5min．     

真藓科(Bryaceae)植物RAPD反应体系的建立

真藓科植物的分子系统学研究是藓类植物研究中的新热点,RAPD是分子系统学研究中被广泛采用的一项重要技术.为了开展真藓科植物的分子系统学研究,通过单因素实验结合正交实验建立了适于该科植物的RAPD最佳反应体系:dNTP为0.2 mmol/L,随机引物0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.25 U,Mg2 为2 mmol/L,模板DNA为50 ng,扩增体系为25μL.确定扩增程序:95℃预变性7min;94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2 min,40个循环;72℃终延伸7 min.并利用该体系从200条随机引物中筛选出了31条高度多态性的引物.     

水稻SRAP-PCR体系的建立与优化

对影响水稻SRAP-PCR扩增结果的模板质量浓度、dNTP Mixture浓度、Mg2+浓度以及引物、反应程序进行了探索,获得在使用大连宝生物Taq酶时能够稳定扩增水稻基因组的SRAP-PCR体系:在25μL体系中,合适的模板DNA质量浓度为0.8~1.2 ng/μL,Mg2+浓度为2~3 mmol/L,dNTP浓度为0.15~0.20mmol/L,按照Li和Quiros设计的程序或按照“94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存“的程序进行扩增可以得到较为满意的结果.Li和Quiros设计的30对引物均能用于水稻SRAP-PCR.     

山药基因组DNA的提取和RAPD反应条件的优化

研究了山药基因组DNA的提取方法;对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了最佳的RAPD反应体系:在25μL反应体系中Mg2+浓度为2.0 mmol.L-1,dNTPs浓度为0.25 mmol.L-1,引物浓度为20 pmol.L-1,Taq酶1.5 U,模板DNA为200 ng.扩增程序为:95℃预变性7 min;94℃变性30 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min,共35个循环;72℃终延伸10 min.     

高粱胞质雄性不育及保持系的RAPD技术优化

以高梁细胞质雄性不育系和保持系A1T623A/B,A2V2A/B为材料，考察了Mg^2 ，Taq酶，dNTP，引物，模板等的用量、循环参数及不同的PCR仪对随机扩增多态性DNA（RAPD）反应的影响。结果发现：在25μL体系中，MgCl22．0mmol/L，Taq酶0．75U（1U＝1μmol/min），dNTP0．15mmol／L，引物16．5ng，模板30ng，明0．001％，KCl50mmol。L，Tris10mmol/L（pH8．3）为最佳反应混合物组合。对PeltierThermalCycler200而言，94℃预变性5min，94℃预变性5in，94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃保温5min，共计40个循环为最佳扩增条件；对PerkinElmerCetusDNAtThermalCycler-480而言,采用94℃预变性3min后，前3个循环，94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸2min，后37个循环，94℃变性30s，36℃退火45s，72℃延伸45s，72℃延伸1min，最后72℃保温5min的循环程序可获得理想扩增。并阐述了优化RAPD实验体系的设计原则。     

新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增体系的优化

以3个新疆杏品种的叶片为试材,以其叶片基因组DNA为模板,分别对PCR扩增体系中的10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、TaqDNA聚合酶和退火温度5个因素设计6个梯度,研究了新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增条件,建立其优化的PCR扩增体系。研究结果表明:其扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸2min,35个循环后72℃延伸10min,25μL反应体系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP0.08mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA80ng,DNA聚合酶1μL,此为最优的反应体系。     

狗脊蕨(Woodwardia japonica(L.F.)Sm)基因组DNA提取与随机扩增多态性DNA(RAPD)的优化

以狗脊蕨新鲜叶片为材料,使用改良的CTAB法提取其基因组DNA,通过单因子实验优化了各反应物的浓度,即在25μL总反应体系,Mg2 (2.5 mmol/L),dNTPs(200 mmol/L),DNA(15 ng),Taq酶(1.5 U),引物(0.15μmmol/L),扩增程序为:94℃预变性1 min,然后94℃变性1 min,39℃退火1min,72℃延伸2 min,40个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存.狗脊RAPD条件优化为分析狗脊蕨的遗传多样性打下稳定的基础.     

菊花iPBS分子标记的建立及优化

菊花是一种重要的观赏花卉,反转录转座子在其遗传多样性形成中发挥着重要作用.iPBS分子标记技术是一种基于反转录转座子的分子标记技术,建立此标记体系可用于检测菊花品种的多样性.本研究对菊花iPBSPCR体系进行优化,得到的最佳反应体系为:引物浓度0.40μmol/L,dNTPs浓度0.40 mmol/L,Mg2+浓度1.80mmol/L,Taq酶浓度0.10U,DNA模板用量60ng,反应总体积20.00μL.反应程序为:95℃预变性3min;95℃变性15s;48℃退火1min;68℃复性1min,30个循环;最后72℃延伸5min.依据上述iPBS-PCR反应体系和程序,从25个iPBS引物中筛选得到2个多态性较高的引物,对8个菊花品种进行iPBS-PCR扩增,结果显示所选用引物扩增效果较好,可以应用于菊花种质资源材料的iPBS分子标记分析.     

草地早熟禾ISSR-PCR反应体系优化

采用正交设计和单因子试验结合的方法,优化适合于草地早熟禾的ISSR体系。对影响ISSR-PCR的多个因素,包括MgCl2、dNTP、Primer、TaqE的浓度和用量进行优化,同时,对DNA模板浓度、引物退火温度进行筛选。确定草地早熟禾的最佳ISSR-PCR反应体系为：94℃预变性5min,94℃变性30 s,Tm值退火45 s,72℃延伸90 s,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存;20μL反应体系包括2μL10×Buffer,0.96μL dNTP（2.5×10^-3mol.L^-1）,1μL Primer（1.0×10^-5mol.L^-1）,0.2μL Taq酶（5 U.μL^-1）,1μL Template DNA,14.84μL H2O。     

杉木SRAP-PCR体系优化

为建立杉木SRAP-PCR反应体系,利用L₁₆(4⁵)正交设计对影响杉木SRAP-PCR反应体系的Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5种因素的4个水平进行优化实验,结合正交直观分析和方差分析,对影响反应较大的Mg²⁺、dNTPs和引物浓度进行单因素实验,最终确定杉木SRAP-PCR最佳的反应体系为:在20 μL的PCR反应体系中,Mg²⁺浓度为2.25 mmol/L、dNTPs为0.15 mmol/L、引物浓度为0.4 μmol/L、Taq酶为1.5 μmol/min、模板DNA为60 ng,10×PCR Buffer 2 μL,不足部分用双蒸水补充至20 μL。PCR反应程序的两步最适退火温度第1步为35 ℃,第2步为53 ℃。利用上述反应体系进行杉木PCR扩增,能得到清晰、稳定的条带。     

欧洲甜樱桃RAPD反应体系的建立与优化

以欧洲甜樱桃萨米托品种为研究对象,利用改进的CTAB法提取基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,筛选了模板、Mg2＋、TaqE、dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立了欧洲甜樱桃RAPD技术扩增体系．研究结果表明,在25出反应体系中,各组分最佳的浓度分别为：10×Buffer2．5μl,2．5mmol·L^-1Mg2＋2．5μl,Taq E0．06U·μl^-1,0．2mmol·L^-1dNTPs,0．2μmol·L^-1Primer,模板DNAl．2ng·μl^-1．PCR循环程序为：94℃预变性4min。94℃变性40s,36℃退火45s,72℃延伸1min,共36个循环,最后72℃延伸7min．     

观赏海棠SSR-PCR体系优化及引物筛选应用

【目的】为探究适用于观赏海棠SSR反应分子标记研究的最佳PCR反应条件,采用正交设计法对观赏海棠SSR-PCR体系进行优化,并利用优化体系筛选适于观赏海棠的多态性SSR引物。【方法】以6个二倍体观赏海棠DNA模板为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验对DNA模板浓度、Taq酶浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度和dNTP浓度进行优化实验,确立了观赏海棠SSR-PCR最佳反应体系。【结果】得出15 μL优化体系各成分为:DNA模板5 mg/L、Taq酶1.25 U、引物0.3 μmol/L、Mg²⁺ 2 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、1×Buffer1.5 μL。利用优化体系在73对苹果属SSR引物中筛选出15对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR 引物并确定各引物的退火温度,其多态信息含量均大于0.25。【结论】正交试验结果达到优化目的,利用优化体系筛选的15对多态性引物可直接应用于观赏海棠SSR分子标记实验中,为观赏海棠品种鉴定、分类以及遗传育种等研究提供了有效工具。     

爱玉ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子试验和正交设计,对影响爱玉ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度、延伸时间和循环次数等指标进行优化.实验确立了可用于爱玉ISSR-PCR分析最适宜的反应体系：20 μL反应体积中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs;PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸2.5 min,共35个循环;72 ℃延伸7min,4 ℃保存.应用该体系对14份爱玉种质进行扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

仁用杏SRAP-PCR体系的正交设计优化

改良CTAB法提取仁用杏基因组DNA,用于建立SRAP-PCR体系。采用L16（44）正交设计试验,对影响仁用杏SRAP-PCR反应体系的4因素（dNTPs浓度、Mg^2＋浓度、引物浓度、Taq聚合酶量）4水平进行筛选,PCR结果经统计软件SPSS V13.0分析,并对退火温度进行了摸索,确立了仁用杏SRAP-PCR的优化体系：总体积为20 L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg^2＋浓度为2.5mmol/L,引物浓度为0.9μmol/L,Taq聚合酶量为1.5 U,退火温度为52℃。本优化体系为仁用杏资源遗传分析奠定了技术基础。     

毛细管电泳-安培法测定酵母菌中的RNA

报道了通过毛细管电泳-安培检测法测定腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)来间接测定酵母菌中核糖核酸含量的方法.探讨了电极电位、运行缓冲溶液、分离电压及进样时间等对毛细管电泳分离-安培检测的影响,得到了较为优化的测定条件.在30 mmol/L 的硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中,上述两组分可在18 min 内完全分离.腺嘌呤和鸟嘌呤的检测限分别为2.0×10^-7mol/L和1.7×10^-7 mol/L.该法具有较好的重现性和灵敏度，可以用于食品中酵母菌中核糖核酸的快速测定.     

巴马香猪CYP3A29 mRNA表达的TaqMan定量方法学建立

目的建立巴马香猪CYP3A29m RNA表达的TaqMan定量方法。方法通过RT—PCR、TA克隆等技术制备CYP3A29-pMDl8-T和β-actin—pMDl8-T实时荧光定量标准品,并以CYP3A29-pMDl8-T标准品为模板,对不同浓度Mg^2＋与探针组合的TaqMan反应体系进行筛选,TaqMan PCR方法,并对其有效性及重复性进行评价。结果筛选到的TaqMan PCR方法为：PCR总体积10μL,其中含l×Buffer、5．5mmol／L Mg^2＋、0．8mmol／L dNTPmix、0．3μmol／L上下游引物、0．2U/μL rTaq、0．1 μnoL／L探针、1μL模板,热循环条件为94℃ 5 min→40cycles（94℃15s→60℃45s→读板）。结论建立了有效测定巴马香猪CYP3A29 mRNA拷贝数浓度的TaqMan PCR方法,通过该方法分别定量CYP3A29和β-actln mRNA的拷贝数浓度,即可求出CYP3A29 mRNA的表达水平。