Ri质粒在绿豆离体器官培养中转导发根的全息现象

生物体每个相对独立部分的结构和功能,都是其整体结构和功能的成比例的缩小,这种现象称为生物全息律.以绿豆(Phaseolus radiatus L.)的上下胚轴和叶片为外植体,进行了Ri质粒转化根的试验.结果表明,离体的绿豆上下胚轴和叶片,在进行发根培养时,同样存在着生物全息现象.这种现象为研究离体器官的形态发生,以及发根农杆菌Ri质粒的发根效应,提供了一种新的观点.     

Ri质粒与发状根的研究概况

本文从Ri质粒转化植物细胞的机理。发根农杆菌诱导能力的影响因素。Ri质粒的质应用，问题及展望四个方面对Ｒi质粒与发状根的研究进行了综述，详尽介绍了利用Ri质粒转移外源基因，接种。发状根除菌，发状根的增殖，发状根的选择与分化，再生植株的检测和利用发状根的培养技术生产天然有用物质及扩大植物基因资源和促进生根等方面的研究结果。     

怀牛膝毛状根诱导及培养体系的建立

以牛膝叶片为外植体,研究了不同发根农杆菌、培养基、乙酰丁香酮(AS)对毛状根诱导率及其生长的影响.结果表明,发根农杆菌不同菌种对牛膝叶片转化率有显著影响,3个供试菌种中ATCC15834菌株诱导率最高;在1/2MS无激素固体培养基上毛状根的诱导率及生长状况均优于MS培养基;100μmol·L-1 AS可以有效提高毛状根诱导率.毛状根从叶片形态学下端中脉切口处形成的愈伤组织上产生,能在无外源激素的培养基上自主生长.PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在牛膝毛状根基因组中插入、整合并得到表达.建立了牛膝毛状根诱导培养体系,为利用毛状根大规模生产药用成分奠定了基础.     

Ri质粒转化及其在植物基因工程中的应用

发根农杆菌Ｒｉ质粒为一种植物基因工程新载体。近年来，国内外对Ｒｉ质粒的遗传转化进行了大量的研究，本文结合自己的一些研究工程对Ｒｉ质粒转化及其应用作一综述。     

Ri质粒转化及其在植物基因工程中的应用

发根农杆菌Ｒｉ（Ｒｏｏｔｉｎｄｕｃｉｎｇ）质粒为一种植物基因工程新载体。近年来，国内外对Ｒｉ质粒的遗传转化进行了大量的研究，本文结合自己的一些研究工作对Ｒｉ质粒转化及其应用作一综述。     

银杏发根的转化及其悬浮培养无性系的建立

运用具有Ｒｉ质粒的发根农杆菌对银杏的叶片，幼芽和幼茎进行成功地转化，并建立银杏发根的悬浮培养无性系，冠瘿碱检测实验表明，发根农杆菌Ｒｉ质粒的Ｔ－ＤＮＮＡ部分已整合到银杏细胞中，这为利用生物技术开发银杏资源提供一条新的途径。     

地黄毛状根的培养研究

发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌,能侵染大多数的双子叶植物,诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根.本实验用发根农杆菌感染地黄外植体诱导其产生毛状根,并加以培养,为今后选择合适的培养方式,大规模培养毛状根来生产地黄的次生物质奠定基础.     

转乙肝病毒表面抗原基因烟草发根的获得

构建了乙肝病毒表面抗原基因（HBsAg）植物表达载体,通过冻融法将HBsAg 基因转入到发根农杆菌LBA1314中,采用叶盘法将HBsAg基因导入到烟草中,获得了转基因烟草发根.对转基因烟草发根的GUS检测结果表明：转HBsAg基因烟草发根可以染成蓝色,而非转基因烟草的根没有染色反应.这说明gus基因在转HBsAg基因烟草发根获得了表达.     

农杆菌转化植物细胞的机理及其基因工程

农杆菌T—DNA能进入植物细胞并稳定地保存在植物染色体中,成为植物细胞新增的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代。这是自然界中存在的原核生物对真核生物进行基因工程的奇妙例证。 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacient)和发根农杆菌(A.rhizogenes)的一些菌株几乎侵染所有受伤后双子叶植物的能力,它们是同属于根瘤菌科的革兰氏阴性菌。它们能分别在宿主植物的感染部位引起冠瘿瘤(Crown gall tumor)和发根瘤(Hairy root tumor),一旦诱导后,冠瘿瘤或发根瘤不需要这些细菌也能增殖。这说明农杆菌的遗传物质能进入宿主细     

用斑点免疫结合法检测转化的烟草植株中的TMV—CP和CMV—CP

1982年,Hawkes 等人仿照分子生物学中点杂交(dot hybridization)的方法发展了斑点免疫结合测试技术(DIBA)用于检测单克隆抗体。本实验就 DIBA 应用在检测转基因烟草。烟草用发根农杆菌 Ri 质粒介导,将烟草花叶病病毒外壳蛋白基因(TMV—CP)和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV—CP)导入烟草的叶片外植体中,通过对外植体的培养,得到愈伤组织,从愈伤组织进而获得了再生植株,对再生植株进行检测导入的外壳蛋白基因的表达量。     

银杏毛状根的诱导和培养

利用３个发根农杆菌菌株：Ｒ１５８３４,Ｒ１０００和Ａ４分别对银杏幼叶、幼芽和幼茎外植体进行成功的转化：除Ａ４外,均诱导获得了毛状根。通过对毛状根中冠瘿碱的检测,农杆菌Ｒｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ部分已整合到银杏细胞的基因组中。     

芸芥发状根的诱导及其植株再生体系的建立

通过发根农杆菌R1000介导的遗传转化建立了芸芥发状根的诱导、培养及植株再生体系.研究了影响发状根诱导及生长的各种因素,通过PCR对所得发状根进行了分子水平的鉴定.结果表明:发根农杆菌R1000的rol B基因已被成功地转入并整合到该发根培养物的基因组中.     

一种快速的重组农杆菌PCR鉴定方法

建立一种快速的重组农杆菌PCR扩增鉴定方法,采用煮沸法处理重组农杆菌,使农杆菌高温裂解,释放质粒DNA,直接进行PCR扩增反应,检测目的基因片段.结果表明,重组质粒PCR扩增效果较好,目标条带较为明显.通过煮沸重组农杆菌,进行PCR扩增反应鉴定质粒DNA,不仅实验操作简单安全,缩短实验时间,并且避免了酚、氯仿试剂在提取质粒DNA过程中的残留对后续分子鉴定质量的影响.     

根癌农杆菌电击转化条件的研究

探索了根癌农杆菌EHA105的高效转化方法.将双元载体质粒pBIN19/glgB经电击转化法导入根癌农杆菌EHA105,研究不同实验条件对转化率的影响.结果表明:在细胞浓度OD600为1.0时进行电转化,转化率最高,达到每微克DNA1.12×105CFU;当电场强度为11 kv/cm,转化率最高,达到每微克DNA1.78×105CFU;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细胞浓度密切相关,转化率随着细胞浓度的上升而上升;质粒大小能影响电击转化率,转化率随着质粒的增大而下降.应用该优化的电击转化条件将双元载体质粒pBIN19/glgB成功导入根癌农杆菌EHA105,构建了植物双元表达载体.     

超声波辅助的发根农杆菌对黄瓜的遗传转化

由于超声波处理可在外植体上产生许多微小伤口,从而提高农杆菌与外植体之间的接触面积,提高农杆菌对外植体的转化频率。用野生型发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)A4菌株感染黄瓜（Cucumis sativus L.) 无菌苗的子叶和下胚轴,建立了黄瓜的发根遗传转化体系。同时,对超声波处理时间、外植体放置方向、预培养时间、外植体类型、乙酰丁香酮的添加与否等影响因素进行了研究。结果表明,采用外植体在添加0．5mg/L NAA和2mg/L 6-BA的MS培养基上预培养4d,超声波处理2s,共培养3d,在预培养共培养期间子叶上表皮向下可以取得最佳的转化效果,发根诱导率为94．7％。乙酰丁香酮对发根诱导频率影响不明显。冠瘿碱检测表明,发根确定能合成农杆碱。     

发根农杆菌转化胀果甘草的研究

利用发根农杆菌R1601对药用植物胀果甘草(Glycyrrhiza inflat Bat)进行转化,诱导其产生发根.在发根诱导过程中,分别用不同菌液浓度、不同浸染时间对胀果甘草子叶、胚轴进行转化处理,统计、比较各条件下的发根率,为发根进行液体悬浮培养以及随后的规模性培养提供数据基础.结果表明,用稀释2倍的茵液浸染子叶8 min时,发根诱导率最高,为56.49%.     

罗勒毛状根培养体系的优化

为寻找最佳罗勒毛状根培养体系优化方案,用四种发根农杆菌A4,R1601,C58C1,15834诱导药用植物罗勒外植体产生毛状根.实验从外植体、菌株、侵染时间、共培养四个因素优化罗勒毛状根培养体系.结果表明,用发根农杆菌R1601诱导罗勒叶片,预培养时间48h、共培养时间48h、侵染时间6min时,出根效果最好;用1/2MS液体培养基继代培养30d最佳.     

发根农杆菌在植物细胞壁上受体位点的研究

刚分离的烟草和元麦叶肉原生的南体及用植物细胞壁再生抑制剂处理的上述原质体分别与发根农杆菌共培养，未发现农杆菌的附着；随着原生质体壁再生时间的延长，农杆菌的附着率逐渐的增加；用植物细胞主要组分的水解酶和ＴｒｉｔｏｎＸ－１００分别处理３日龄烟草叶肉原生质体后，进行随着菌数的放射性分析，结果表明，细菌对经过胰蛋白酶和ＴｒｉｔｏｎＸ－１００处理的细胞的附着率显著下降，ＴｒｉｔｏｎＸ－１００提取液中含有糖蛋     

异戊烯基转移酶基因克隆及植物表达载体构建

根据已知的异戊烯基转移酶基因保守序列设计引物,以根癌农杆菌C58的Ti质粒为模板,采用PCR方法扩增获得了异戊烯基转移酶基因723bp的片段.将该片段回收,连接到pMD18-T载体测序,测序片段经酶切回收后克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α.将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105,经菌液和质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-ipt,这为异戊烯基转移酶基因功能的进一步研究提供了基础.     

应用毛状根转化技术获得植物次生代谢产物的研究 Ⅰ.萝芙木毛状根的诱导与培养

将萝芙木(Rauvolfia verticillata)的无菌苗被含有Ri-质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染后,诱导出毛状根(hairy root)。将毛状根分离,除菌后,在不含激素的MS琼脂培养基上培养。为进一步研究萝芙木毛状根的遗传表达以及次生代谢产物的定性定量分析奠定了基础。