PCR技术在动植物检疫中的应用

一、PCR技术基本原理多聚酶链式反应,英文缩写为PCR,又称无细胞分子克隆法,是近年发展起来的一种快速的特定DNA片段体外扩增法,即一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法.PCR利用两个寡聚核苷酸杂交对应链目的区域的侧翼上,一连串反应包括模板变性作用、引物退火和由DNA聚合酶酶促退火、引物延伸的周期性重复产生特定片段的指数积聚.该片段的末端由引物的5′末端决定.因为一个周期所合成的引物延伸产物可作为下一个周期的模板,所以靶DNA拷贝数目在每个周期中近似地呈倍数增加.这样,20个PCR周期可得约百万(2~(20))倍扩增.把扩增产物放进电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼能看见扩增特异区段的DNA带.     

表型与表没食子型配对茶儿茶素酶促形成茶黄素机制

为了阐述多酚氧化酶酶促儿茶素转化生成茶黄素的作用机制,利用酶促反应考察各儿茶素单体的独立催化过程,结果前9min的平均消耗速率分别为ECEGCGECGEGC.配对双儿茶素酶促反应,表没食子型儿茶素消耗速率被加快的同时降低了表型儿茶素的消耗速率,且能抑制茶黄素不被进一步降解.当表没食子型儿茶素消耗怠尽后,表型儿茶素在酶促作用下可进一步分解生成的茶黄素.除茶黄素TF-D-G外,消耗的表型儿茶素接近于其他类型茶黄素的生成量.同类型儿茶素在与配对儿茶素酶促化合反应形成对应的茶黄素时存在竞争性.在表型与表没食子型儿茶素的配对反应中,优先氧化表没食子型儿茶素反应生成的茶黄素的量高于优先氧化表型儿茶素反应中其相应茶黄素的生成量.另外,双氧水、还原试剂及十二烷基磺酸钠亦能够显著影响茶黄素的酶促合成过程.     

发夹状核酶G11 突变对体外切割活性的影响

为了研究发夹状核酶结构中G 11 特定核苷酸对于其体外切割活性的影响,用 32 P标记长度为267nt含有乙型肝炎病毒C区pKC的体外转录物作为靶RNA,把合成的G 11 位突变的发夹状核酶基因片段克隆入自剪切核酶载体p1.5内形成pHpRz;利用 32 P标记pHpRz的体外转录物,凝胶电泳进行核酶的鉴定和纯化.把未标记的各种核酶与同位素标记的靶RNA在不同条件下进行切割反应,凝胶电泳,放射自显影分析反应结果.切割结果显示与底物的靶序列完全互补的发夹状核酶具有最高的切割活性,随着与靶序列的互补能力降低发夹状核酶的切割活性逐渐下降,甚至消失.这表明发夹状核酶结构中的G 11 位点对于发夹状核酶的切割活性不是必需的,所以与发夹状核酶的G 11 位点相对应的靶序列的选择不受此位点的限制.     

用体外定向进化的方法对EPSPS合酶基因草苷膦抗性机制的研究

为了寻找EPSP合酶中某些与草苷膦抗性相关的位点，利用体外定向进化技术，对可变盐单胞菌HT7的EPSP合酶基因，荧光假单胞菌G2的EPSP合酶基因以及按植物偏爱密码子合成G2的EPSP合酶基因，进行DNA shuffling，通过EPSP合酶缺陷型菌株E.coil ER2799的功能互补筛选，获得了7个草苷膦抗性有较大变化的EPSP合酶突变体.     

生命的旋律——“DNA音乐”

细胞是生命的基本单位。任何生物的细胞核中,都含有一套由遗传物质去氧核糖核酸(DNA)组成的染色体。分子生物学家已经探明,染色体是由两条 DNA 长链缠绕而成的双螺旋结构。DNA 含有4种类型的碱基,即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。每条 DNA 长链上的腺嘌呤和胸嘧啶配对互补,而鸟嘌呤则和胞嘧啶配对互补。互补的碱基间以氢键联结,成为两条 DNA 长链间的纽带。DNA 上的碱基排列,就是生命世界最奥妙的“遗传密码”。每3个碱基决定一种氨基酸。一段去氧核糖核酸链,能够决定一组氨基酸排列顺序。按这个顺序合成的氨基酸长链,就是支配生物某一性状表现的一种蛋白质分子。所以遗传决定性状,说到底就是碱基排列顺序     

TIAR通过在DNA和RNA之间的穿梭机制调控DNA的转录活性

应用体外转录模型,即通过构建T7 及T7 TIAR 的碱基序列及部分退火的双链模型,合成了一段ODN,其包含单链的TIAR结合位点和1个T7的起始位点.通过进行RNA转录分析,TIAR的结合和替代实验,证明了TIAR可与富含T的单链DNA结合,并且TIAR与DNA的结合可因DNA的转录活性而解离.这一发现为TIAR可在DNA与RNA之间穿梭提供了证据.     

脂肪酶催化制备丁酸乙酯的研究

利用脂肪酶BSL2作为催化剂,在有机介质中催化合成丁酸乙酯.考察了反应温度、底物浓度、底物摩尔比、反应介质和初始水活度等反应条件对酶促合成丁酸乙酯的影响.试验结果表明:以正己烷为溶剂,初始水活度为0.33,加酶量为100 mg,丁酸浓度为40 mM,底物摩尔比(丁酸/乙醇)为1∶1.5,在40℃条件下振荡反应30 h,合成丁酸乙酯的的转化率可达到94.8%.     

小麦染色体配对基因Ph1结构剖析及调控机制研究进展

近年来,关于小麦抑制部分同源染色体配对基因Ph1的研究有了突破性进展.本文对该基因的结构和调控机理的最新研究进行综述.通过创造和分子标记鉴定Ph1缺失突变体,利用分子生物学及比较基因组学技术,该基因位点被界定于5BL上一个2.5 Mb的区域内,含有一个类cdk基因簇,且在该类cdk基因簇中插入一个亚端粒异染色质片段.细胞学研究显示,Ph1基因通过控制亚端粒的互作启始染色体识别和配对伙伴选择.与此同时,生物信息学揭示,这些类cdk基因与人类和老鼠的cdk2基因高度同源,它们与细胞周期中DNA复制、染色质凝集、碱基错配修复等事件相关.减数分裂时,该基因位点通过"感知"染色体的同源性程度而触发染色质的构象变化,从而控制染色体的配对和重组.此外,小麦中可能存在一种与Ph1相关的类似于酵母中的粗线期检查点机制.预测未来的研究将可能集中在Ph1对染色体同源性的"感知"机制、Ph1的开启与关闭、植物减数分裂重组的忠实性及减数分裂过程的检查点机制等方面.     

耐热DNA聚合酶介导的DNA酶促自发合成

构建了无模板引物的“类ＰＣＲ体系”。该体系在适当温度保温一段时间之后，能检测到产物出现，利用热变性分析等手段，初步研究了产物的性质，发现这些产物是随机合成的具有一些特殊构型的ＤＮＡ。本文报道三种构型，两类碱基组成比例，并通过改变反应条件观察对酶促自发合成的影响，探讨耐热ＤＮＡ聚合酶的非特异聚合活性以及介导的酶促自发合成的机理和意义。     

新疆野生啤酒花DNA提取及RAPD反应体系的建立

采用2种方法提取啤酒花的基因组DNA，并分析了样品的不同状况和是否纯化对所提DNA质量及其RAPD扩增效果的影响。结果表明：采用改进的高盐低pH法优于CTAB法。以此法所提DNA为模板进行随机扩增多态DNA(RAPD)试验，分别测试了Mg2 ,dNTP、Taq酶、模板DNA浓度和退火温度对反应结果的影响，最终确定了野生啤酒花RAPD反应的最佳体系。     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立

以油茶品种大别山2号和赣兴46为试验材料,利用Me5Em8正反向引物组合进行了SRAP-PCR反应体系的L9(34)正交试验,采用正交设计直观分析及方差分析对影响SRAP反应的Taq聚合酶、Mg2+、dNTP和引物浓度进行分析,并对模板DNA浓度进行了单因素试验分析。结果表明,油茶SRAP-PCR 20 μL反应体系的最佳组合为: Taq聚合酶1.20 μmol/min、Mg2+浓度125 mmol/L、dNTP浓度0.15 mmol/L、Primer浓度0.60 μmol/L、模板DNA含量60 ng,并含有2 μL 10×buffer(Mg2+ free)。各因素对油茶SRAP-PCR反应的影响大小依次为:dNTP、 Mg2+ 、Taq聚合酶、Primer。     

极度濒危植物猪血木RAPD反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取中国特有极度濒危植物猪血木(Euryodendron excelsum H.T.Chang) 嫩叶总DNA,并对其进行RAPD分析.分别检测了模板DNA、引物、dNTP、Mg2+和Taq DNA聚合酶用量对反应结果的影响.筛选并建立了适合于猪血木RAPD扩增的反应体系:总体积25 μL,其中10×PCR 缓冲液(500 mmol/L KCl,100 mmol/L Tris-HCl,110% Triton X-100,20 mmol/L MgCl2) 2.5 μL,引物( 1.5 μmol/L) 0.3 μL,dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL,模板2 μL (25 ng),Taq 酶0.2 μL (0.5 U).     

观赏海棠SSR-PCR体系优化及引物筛选应用

【目的】为探究适用于观赏海棠SSR反应分子标记研究的最佳PCR反应条件,采用正交设计法对观赏海棠SSR-PCR体系进行优化,并利用优化体系筛选适于观赏海棠的多态性SSR引物。【方法】以6个二倍体观赏海棠DNA模板为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验对DNA模板浓度、Taq酶浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度和dNTP浓度进行优化实验,确立了观赏海棠SSR-PCR最佳反应体系。【结果】得出15 μL优化体系各成分为:DNA模板5 mg/L、Taq酶1.25 U、引物0.3 μmol/L、Mg²⁺ 2 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、1×Buffer1.5 μL。利用优化体系在73对苹果属SSR引物中筛选出15对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR 引物并确定各引物的退火温度,其多态信息含量均大于0.25。【结论】正交试验结果达到优化目的,利用优化体系筛选的15对多态性引物可直接应用于观赏海棠SSR分子标记实验中,为观赏海棠品种鉴定、分类以及遗传育种等研究提供了有效工具。     

西瓜种植物RAPD分析影响因子的研究

以西瓜种内的１２个品种（系）为模板ＤＮＡ,研究了影响ＲＡＰＤ扩增效果的因素。结果表明,模板ＤＮＡ、Ｔａｑ酶、随机引物、Ｍｇ２＋浓度以及ＰＣＲ反应程序在ＲＡＰＤ分析中都具有重要的作用。根据以上因子的研究结果,建立了适合西瓜种植物的ＲＡＰＤ分析的技术体系：１０μＬ反应液中,模板１０ｎｇ／１０μＬ,引物０５μｍｏｌ／Ｌ,ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８３）５０ｍｍｏｌ／Ｌ,ＢＳＡ５００μｇ／ｍＬ,ＭｇＣｌ２２５ｍｍｏｌ／Ｌ,ＴａｑＤＮＡ０６Ｕ／１０μＬ,ｄＮＴＰｓ２００μｍｏｌ／Ｌ,１０％蔗糖４００和１ｍｍｏｌ／Ｌ甲酚红。     

Single-molecule studies of the effect of template tension on T7 DNA polymerase activity

T7 DNA polymerase catalyses DNA replication in vitro at rates of more than 100 bases per second and has a 3'-->5' exonuclease (nucleotide removing) activity at a separate active site. This enzyme possesses a 'right hand' shape which is common to most polymerases with fingers, palm and thumb domains. The rate-limiting step for replication is thought to involve a conformational change between an 'open fingers' state in which the active site samples nucleotides, and a 'closed' state in which nucleotide incorporation occurs. DNA polymerase must function as a molecular motor converting chemical energy into mechanical force as it moves over the template. Here we show, using a single-molecule assay based on the differential elasticity of single-stranded and double-stranded DNA, that mechanical force is generated during the rate-limiting step and that the motor can work against a maximum template tension of approximately 34 pN. Estimates of the mechanical and entropic work done by the enzyme show that T7 DNA polymerase organizes two template bases in the polymerization site during each catalytic cycle. We also find a force-induced 100-fold increase in exonucleolysis above 40 pN.     

日本沼虾基因片段PCR扩增的条件优化

以日本沼虾肌肉组织为材料，提取其基因组DNA，研究了该虾16S rRNA基因片段扩增的PCR反应条件.经对扩增反应体系中各因子和扩增程序的梯度实验，确定优化反应条件为: 在25μL反应体系中，10×Buffer 2.5 μL，DNA模板200～300 ng，4×dNTP 0.2 mmol/L，Mg²⁺1.5 mmol/L，引物0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，95 ℃预变性5 min；接着35个循环包括95 ℃变性1 min，56 ℃复性50 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min.应用此优化体系扩增日本沼虾18S rRNA，细胞色素氧化酶亚基I (cytochrome oxidase subunit I, COI),NADH脱氢酶亚基V (NADH dehydrogenase subunit 5, ND5)等基因片段均获得了稳定而理想的效果.研究结果为深入探讨日本沼虾种群的遗传和变异,以及开展其种质鉴定和分子标记等研究提供了参考.     

用加端PCR技术改造h－IGF－1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓｔＩ位点和ＳａｌＩ位点及终止密码子的２个用于扩增ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物．利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增．扩增产物经电泳鉴定后克隆进Ｍ１３ｍｐ１８载体，进行核苷酸序列分析．结果显示：ＰＣＲ产物含已发表的ｈＩＧＦ－１成熟蛋白的编码序列和５＇端的ＰＳｔＩ位点及３＇端的ＳａｉＩ位点及终止密码ＴＡＧ．用加端ＰＣＲ技术成功地扩增和改造了ｈＩＧＦ－１的编码序列．     

枯草芽孢杆菌TY7210菌株的ERIC-PCR快速鉴别

以ER IC核心序列为引物,以2株枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,采用PCR对T aq DNA聚合酶用量、PCR退火温度及模板DNA浓度进行优化,建立了快速鉴别芽孢杆菌的ER IC-PCR方法,并对5株芽孢杆菌进行了分析.结果表明枯草芽孢杆菌TY 7210菌株与其他芽孢杆菌菌株具有不同的指纹图谱,尤其不同于枯草芽孢杆菌(ATCC 1.1849),为芽孢杆菌的快速鉴别奠定了基础.     

利用正交设计优化一品红SRAP反应体系

运用L16（4^5）正交设计对影响一品红SRAP反应的5个因素（DNA模板浓度、M矿’浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶）在4个水平上进行优化试验,PCR结果采用DPSV3．01软件分析。结果表明,各因素对SRAP反应的影响依次为：Mg2＋〉引物〉dNTPs〉DNA模板〉Taq酶;一品红SRAP反应最佳体系为：50μL的PCR体系中含有Mg2＋ 2．5mmol·L-1．引物500pmol·L-IdNTPs 0．20mmol·L-1．DNA模板100ng、Taq酶1．0U;应用最佳反应体系对PCR程序中的退火温度进行优化,得出SRAP—PCR反应适宜的第一步退火温度为36℃,第二步退火温度为50℃。