克氏原螯虾主要变应原原肌球蛋白的一个片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

克隆克氏原螯虾主要过敏原原肌球蛋白的一个片段区基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫原性.提取克氏原螯虾总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆得到目的基因;将目的基因连入pMD19-T载体,提质粒酶切鉴定并测序;将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;利用Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的免疫原性.克隆获得目的基因,其片段长为291 bp,编码97个氨基酸.重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting和ELISA结果表明该蛋白与克氏原螯虾过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性.     

小龙虾钙结合蛋白基因表达及纯化

从小龙虾(Procambarus clarkii:pc)的肌肉组织中提取其总RNA,设计特异性引物,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆出编码小龙虾钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein:SCP)基因片段,扩增片段为582 bp.该序列与已报道的几类虾SCP序列比对结果表明:在氨基酸水平上同源性为81%～96%.将SCP基因与pET-28a载体连接,构建了原核表达载体pET-28a-peSCP重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE结果表明:表达蛋白约为22 kDa,与预期的相对分子质量大小相符.并用Ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化,得到了纯度较高的pcSCP.研究重组蛋白peSCP的获得,为pcScP变应原性及相关的研究奠定基础.     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

重组基质金属蛋白酶MT5-MMP的表达、 纯化和复性

对已经构建成功并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的基质金属蛋白酶MT5 MMP的催化结构域进行诱导表达, 得到分子量为21000, 包涵体形式的重组蛋白. 通过离子交换树脂对目的蛋白进行纯化后, 用凝胶过滤树脂对纯化后的蛋白进行柱上复性, 得到了具有较高活性的重组蛋白.     

全细胞生物转化法制备γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)是广泛存在于自然界的一种非蛋白质的功能性氨基酸.它是哺乳动物中枢神经中一种重要的抑制性神经递质.为了高效廉价制备GABA,采取谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸生成GABA的工艺.从K12来源的大肠杆菌(E. coli)基因组中PCR扩增得到GAD基因片段,并克隆到载体p ET-23a中,得到重组质粒p ET-23a-K12gad,并将其转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中,获得了能够重组表达GAD活性的工程菌株.从反应温度、p H、菌体量这三个方面对催化工艺进行了优化.为了进一步降低成本,通过化学法将谷氨酸钠转化为谷氨酸作为催化底物,提高转化速率的同时简化了纯化工艺.     

亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择

以ZG1( )、ZG1(-)、ZG2( )、ZG2(-)、ZG3( )、ZG3(-)寡聚核苷酸片段为材料，合成了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA必需的35个氨基酸的折叠片段，将此片段分别克隆到pET3b质粒和pBLZ质粒中．酶切后用2％琼脂糖电泳检测证明两者克隆成功．将这2种重组质粒分别转化到E.coli DH5a中．发现pET3b重组体在E．coli DH5a中表达成功．而pBLZ质粒重组体在E．coli DH5a中不能成功表达；从转化子中分离得到重组质粒pET3b,酶切和序到分析都证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因．     

GST和His标记的重组蛋白制备及吸附纳米ZnO的研究

以pET-28a(+)载体为模板人工设计引物,通过PCR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine)序列的目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,筛选及鉴定阳性重组子pGEX-His,转化E.coli BL21细胞后通过IPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)和6聚组氨酸标记的重组蛋白GST-His得到表达,利用Ni-NTA系统进行纯化.通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定,由LC-MS/MS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.     

粉尘螨过敏原脂肪酶的表达、纯化及生物信息学分析

为克隆原核表达并纯化出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,鉴定其免疫学活性,并分析其分子特征.通过重组合成粉尘螨新过敏原脂肪酶基因,与p ET-28a载体连接后转化大肠埃希菌E.coli Top10,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组新过敏原脂肪酶蛋白;经镍柱亲和层析纯化出粉尘螨重组脂肪酶蛋白,用Western Blot、ELISA方法检测其免疫原性.用生物信息学软件预测其理化性质、二级结构,并构建分子进化树.成功表达纯化出高纯度的粉尘螨重组脂肪酶蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示表达重组产物分子质量约为40 k Da,与理论值一致,纯化后的表达产物经Western blot印迹检测有明显条带显示.信息学分析显示蛋白二级结构由α螺旋(16.38%)、延伸主链(18.93%)、无规则卷曲(64.69%)组成.成功原核表达出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,并纯化获得较高纯度及较强免疫学活性的重组脂肪酶蛋白,为尘螨过敏性疾病的特异性诊断和免疫治疗奠定理论基础.     

乙型肝炎病毒HBX基因的克隆、表达和蛋白的纯化

克隆乙肝病毒X基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结乙肝病毒基因组扩增出HBX基因片段,克隆至pMD18-T载体中。序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProExHTa并在大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆了HBX基因,并对其在E.coli中进行了表达。SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过IMAC纯化系统获得17 kD纯化蛋白,与文献报道相符。结果成功获得了纯化的HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定基础。     

β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的克隆与表达

为研究重组β琼脂糖酶(AgaA7)基因的表达产物及其生物活性,根据GeneBank中β琼脂糖酶(AgaA7)基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体PQE30中,测序结果证明合成基因序列正确,未改变读码框.然后将此表达载体转入E.coli M15中进行诱导表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并鉴定其生物活性.结果表明:其相对分子质量约为5.0×104,与预期相符,具有生物活性.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Hsp70基因PCR扩增及序列分析

目的：为获得凡纳滨对虾的热休克蛋白70（Hsp70）基因并分析其基因序列．方法：根据GenBank中斑节对虾（Penaeus monodon）Hsp70基因的cDNA序列,设计引物,对经高盐法提取的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）基因组DNA,采用优化的降落PCR（Touch Downeca）程序,扩增凡纳滨对虾Hsp70基因的全长序列．结果：PCR扩增得到一条长1983bp的目的DNA片段,回收纯化该片段并测定其核酸序列．用DNAman软件分析发现,该核酸序列中不含内含子,编码区全长为1959bp;经BLASTn和BLASTx软件分析发现,该编码区核苷酸序列与斑节对虾、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的Hsp70基因序列的相似性分别为97％和62．2％．根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾的相似性分别为99．9％和92．6％．结论：成功地从凡纳滨对虾基因组DNA中直接扩增出Hsp70基因的全长编码区序列。     

Cu~(2+)对罗氏沼虾体内SOD酶细胞化学定位的影响

运用电镜酶细胞化学技术显示,罗氏沼虾经高浓度Cu2+(5.12 mg/L)处理一周后,体内3种组织(鳃、肝胰腺和心脏)细胞超微结构均有不同程度的损伤,主要表现为细胞核收缩,线粒体膨胀和内嵴减少,细胞结构模糊、胞质浑浊,髓样小体增多,脂滴破裂等;超氧化物歧化酶(SOD)阳性颗粒在健康虾中主要存在于细胞核、线粒体膜周围和脂滴周围等,Cu2+胁迫后,组织细胞中线粒体膜和脂滴周围的SOD阳性颗粒明显减少,细胞核内SOD阳性颗粒缺失.结果表明:高浓度Cu2+对罗氏沼虾体内3种组织细胞中SOD的表达具有显著抑制作用,可导致虾体免疫机能显著下降,从而出现组织细胞结构明显损伤.     

3种沼虾的16S rRNA基因序列分析

为从分子角度理解3种沼虾,即罗氏沼虾、日本沼虾和祁连沼虾的遗传差异,为沼虾资源的管理、保护和合理开发利用提供理论基础,采集了每种沼虾各2尾样本,采用PCR的方法扩增了其线粒体16S rRNA基因片断并测序。比对后共获得了3种沼虾的297 bp的16S rRNA片断序列,共检测到47个变异位点,总变异率为15.8%。3种沼虾的平均碱基含量分别为T(37.7%)、C(10.9%)、A(29.8%)和G(21.6%)。罗氏沼虾种内个体间序列差异为3%。祁连沼虾和日本沼虾种内个体间差异均为0.7%,且两者种间差异很小,为0～0.7%。罗氏沼虾与祁连沼虾、日本沼虾之间的序列差异在13.1%～14.8%之间,种间差异明显。系统进化树显示罗氏沼虾自成一枝,而日本沼虾和祁连沼虾共同构成另一枝,日本沼虾和祁连沼虾的遗传距离小于5%,结果提示日本沼虾和祁连沼虾有很近的亲缘关系,两者也许是亚种关系。     

罗氏沼虾胚胎发育过程中的脂类变化

采用生物化学方法测定了罗氏沼虾胚胎发育过程中脂类含量和脂肪酸的组成.结果表明：随着胚胎的发育，总脂及中性脂含量明显下降，而磷脂含量趋于稳定，保持在一定水平.脂类在罗氏沼虾胚胎发育中除部分形成组织器官的组成成分外，主要起提供能量的作用.在脂肪酸组成上，胚胎中含量较高的饱和脂肪酸(SFA)有C14:0，C16:0，C18:0，单不饱和脂肪酸(MUFA)有C16:1n-6，C18:1n-9，多不饱和脂肪酸(PUFA)有C18:2n-6，C20:4n-6 (ARA)以及n-3系列的高不饱和脂肪酸(ω-3HUFA) C18:3n-3，C20:5n-3 (EPA)和C22:6n-3(DHA).C18:1n-9和C16:0在罗氏沼虾胚胎发育各时期均占较高比例，是整个胚胎发育期间能量的主要提供者.在胚胎发育的不同时期，作为主要能源的脂肪酸不同.饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸在从受精卵期到原肠期是主要能源，单不饱和脂肪酸在从囊胚期到无节幼体期是主要的能源，多不饱和脂肪酸是从无节幼体期到溞状幼体期的主要能源.     

蛹虫草菌丝对罗氏沼虾免疫功能的影响

在罗氏沼虾饵料中添加w=1%、2%、3%蛹虫草菌丝能提高罗氏沼虾血清PO活力、肌肉SOD活力、 GSH-Px活力,并同时降低MDA含量.经嗜水气单胞菌攻毒后,实验组的免疫保护率也明显提高.结果证明,蛹虫草菌丝可提高罗氏沼虾的免疫能力,增强抗嗜水气单胞菌的能力.     

第一性原理计算锐钛矿型TiO2电子结构及力学性能分析

 基于第一性原理中的密度泛函理论,采用CASTEP程序包,计算分析了锐钛矿型TiO2的能带结构、电子态密度和弹性常数等性能参数. 结果表明,锐钛矿型TiO2 属间接带隙半导,最小能隙为2.2eV. Ti和O之间存在明显的电子转移现象,电子分布具有强烈的定域性,但由于存在杂化现象,Ti-O键还表现出部分共价键特征. 在四方晶系中,这种离子键和共价键混合的网络状复合键结构使材料表现出大的体积弹性模量204.44GPa,由于在TiO2晶体结构中,滑移系统较少,材料断裂时突凸显脆性,韧性差,剪切模量相对较小为64.71GPa.     

水温对罗氏沼虾和青虾心率及组织中镁的影响

罗氏沼虾的心率随水温的降低而变化,在17℃时只有79次 min,为30℃的1 3;其血清Mg的含量随水温的降低而升高,肌肉中Mg有降低的趋势,但差异不明显。青虾心率在水温从24℃到17℃时,无明显改变;血清Mg随水温的降低而升高,但变化幅度小于罗氏沼虾。     

大黄蒽醌提取物对罗氏沼虾抗高温应激的影响

 将罗氏沼虾随机分成5组,每组3个平行,每个平行约1 000尾,第1组为对照组,投喂基础日粮,另外4组为试验组,在基础日粮中分别添加 w 为0.05%、0.10%、0.20%、0.40%大黄蒽醌提取物。饲养8周后,对虾进行连续48 h 35 ℃高温应激,测定其生长、应激前后血淋巴葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、溶菌酶、一氧化氮（NO）等的变化。结果表明：与对照组相比,添加 w=0.10%的大黄蒽醌提取物显著提高了虾的增重率、降低了饵料系数,w=0.40%大黄蒽醌提取物显著增加了血淋巴溶菌酶含量。高温应激后,与对照组相比,添加 w 为0.1%和0.20%大黄蒽醌提取物仍保持较高血淋巴溶菌酶、一氧化氮浓度。高温应激试验表明：对照组死亡率达60%,添加 w为0.10%和0. 20%大黄蒽醌提取物小于30%。因此添加 w 为0.10%和0.20%大黄蒽醌提取物提高了机体抗应激能力,并对高温引起虾的死亡有一定的保护作用,促进了虾的生长。     

罗氏沼虾产业在中国持续增长的经济与社会原因分析

罗氏沼虾作为外来物种自1976年引入中国大陆已有30多年历史。到2009年,全国罗氏沼虾年育苗量达250×108尾以上,养殖面积约3×104 hm2,养殖产量超过13.5×104 t,养殖产值超3.0×109元,已连续10年成为世界第一的罗氏沼虾养殖大国。其持续增长的原因有：1、罗氏沼虾优良生物学特性是其产业发展的前提;2、苗种繁育和商品虾养殖技术的进步支撑了产业的发展;3、对虾养殖产业的波动为罗氏沼虾养殖产业的增长提供了机会;4、中国经济发展带动了国内罗氏沼虾的消费市场;5、政府支持和水产技术推广是罗氏沼虾产业发展的保障和技术支撑。罗氏沼虾生长迅速、养殖时间短、市场稳定、经济效益显著,已成为我国主要淡水养殖虾类。因此,推广罗氏沼虾的健康养殖应是农民脱贫致富的一条有效途径。     

台湾省淡水特优产品养殖现状分析

介绍和分析了台湾省淡水最重要的特优种类──鳗鱼、罗氏沼虾、甲鱼、牛蛙的养殖概况和特优养殖存在问题及展望，提供给我国管理层和养殖者借鉴。使我国淡水特优产品养殖，减少弯路，避免盲目，朝健康稳定方向发展。