纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。     

黄河故道湿地可培养细菌多样性及产木聚糖酶菌株筛选

研究黄河故道湿地可培养细菌的多样性及其产木聚糖酶的应用潜力.采用稀释平板涂布法从湿地样品中获得119株菌株,形态去重复后对93株进行16SrRNA基因系统发育分析以及利用刚果红染色法进行木聚糖酶活性筛选.结果表明,分离得到的菌株分属于4个门的18个科、21个属,其中优势类群为变形菌门(Proteobacteria)(41株,44%).该地区可培养细菌的Shannon-Wienner多样性指数H′=3.66,Simpson指数D=0.97;Margalef物种丰富度指数dMa=10.59;Shannon物种均匀度指数E=0.94,且样点青龙湖多样性指数高于样点刘寨.93株代表性菌株的木聚糖酶筛选结果显示,11.82%具有木聚糖酶活性,链霉菌和芽孢杆菌在木聚糖酶活性菌株中比例最高.以上结果表明豫北黄河故道湿地蕴含丰富的细菌资源,可为木聚糖酶的研发提供良好的菌种来源.     

玉米芯中木聚糖提取方法的研究

采用碱解玉米芯粉末后,玉米芯碱解液用30%(w:v)过氧化氢溶液脱色并且用10%(w:v)三氯乙酸溶液脱蛋白来提取木聚糖,收得率分别为24.4%。并用真菌DSM10635菌株产的木聚糖酶对以三种不同来源的木聚糖以及自提玉米芯木聚糖为底物测得的米氏常数进行比较,还检测比较了DSM 10635木聚糖酶以桦树和自提木聚糖作为底物的最佳酶促反应温度。结果表明,从玉米芯自提木聚糖的Km值7.5303与燕麦木聚糖的Km值5.6044相近,桦树和自提的木聚糖的最佳酶促反应温度也都在65-70℃左右,具有一定的取代性。方法简单,收得率较高的木聚糖提取方法对工业上大量生产具有重要的意义。     

碳源对丝孢酵母(Trichosporon cutaneum ST_(851))生长和β-木聚糖酶诱导形成的影响

以单糖、双糖和多糖等８种有机化合物为碳源，培养丝孢酵母ＳＴ８５１，结果发现该菌株在上述各种碳源中均生长良好，但只有在木糖和木聚糖碳源中培养时，才呈现β－木聚糖酶活性；该菌株所产生的β－木聚糖酶是诱导酶，木糖和木聚糖是良好的诱导物；麸皮和半纤维素可大幅度提高酶活力．在液体或固态培养中，酶活力可分别达到１４．４ＩＵ／ｍｌ和７３．６ＩＵ／ｇ曲．５－氟尿嘧啶和放线菌酮均对该酵母所产的β－木聚糖酶有强列抑制作用     

碳源对丝孢酵母（Trichosporon cuataneum ST851）生长…

以单糖，双糖和多糖等８种有机化合物为碳源，培养丝孢酵母ＳＴ８５１，结果发现该菌株在上述各种碳源中的均生长良好，但只有在木糖和木聚糖碳源中培养时，才呈现β－木聚糖活性，该菌株所产生的β－木聚糖酶是诱导酶，木糖和木聚糖是良好的诱导物，麸皮和半纤维素可大幅主提高酶活力，在液体或固态培养中，酶活力可分别达到１４．４ＩＵ／ｍｌ和７３．６ＩＵ／ｇ曲，５－氟尿嘧啶和放线菌酮均对该酵母所产的β－木聚糖酶有强列抑抽     

交联木聚糖制备工艺的优化和活性检测研究

交联木聚糖RBB-xylan是木聚糖酶在测定和筛选过程中常用的人工合成的色原底物,利用木聚糖和雷玛唑亮蓝制备RBB-xylan的传统方法得率较低.在传统方法的基础上采用改变单一变量对原有的实验方法逐步改进:将硫酸钠的滴加流速调整为0.8 m L/s,增加1 h陈化时间,将沉淀剂乙醇的用量提高3倍,从而使RBB-xylan得率从原来的50.5%提高到84.8%,效果显著.将RBB-xylan添加到平板可快速筛选出产木聚糖酶的菌株.结果表明,合成的RBB-xylan具有活性,可用于后续木聚糖酶的筛选及活性测定.     

高取代度木聚糖衍生物的理化性质

以从麦草中分离得到的木聚糖为原料、丙烯酰胺为醚化剂、碱为催化剂、丁醇/水为反应介质制备了带有高取代度双官能团的木聚糖衍生物.采用13C核磁共振表征了木聚糖衍生物的结构.利用平行板流变仪和同步热分析仪对木聚糖衍生物与原木聚糖的动态流变性能和热稳定性进行测试,结果表明:与原木聚糖溶液相比,木聚糖衍生物溶液呈现较低的粘度,剪...     

水稻内生放线菌降解酶活性的分析

分析了水稻内生放线菌纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶三种酶活性，结果表明：52％的菌株具有纤维素酶活性，35％的菌株具有木聚糖酶活性，61％的菌株具有果胶酶活性．     

鸡致病性E.coli O_(24)基因工程包涵体疫苗的制备及免疫原性

利用已构建的基因工程菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分别可见表达的20ku和40.9ku的特异条带,确定蛋白以包涵体的形式存在.Western blot结果表明,表达的Ⅰ型菌毛蛋白(pilA基因编码)和外膜蛋白(ompC基因编码)可与抗体发生特异性结合,说明其具有良好的反应原性.将表达特异蛋白的重组菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC分别制成基因工程包涵体疫苗,免疫小鼠后,具有很好的保护能力.ELISA结果显示,免疫的小鼠体内已产生相应的抗体,效价为1∶400,说明这2种疫苗有很好的免疫原性.表明这2株基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株.     

木聚糖的提取分离和应用研究进展

木聚糖是自然界中除纤维素外含量最丰富的一种聚糖，而木质纤维素中半纤维素、纤维素和木质素3大组分构成的复杂结构是获得木聚糖的主要障碍。本文结合最新研究成果着重阐述从木质纤维素中制备木聚糖的主要方法及分离纯化策略，介绍木聚糖在食品、医药、材料等领域的应用，并对木聚糖未来的研究发展方向进行展望。     

木聚糖酶高产微生物的筛选和鉴定

利用蔗渣木聚糖为惟一碳源，从甘蔗根部泥土样口中分离得到一株产木聚糖酶活力较高的菌株，经形态、生理及生化鉴定，初步确定为蜂房芽孢杆菌；同时研究了碳源、氮源对该菌产木聚糖酶的影响。结果表明，其最适碳源为木聚糖，最适氮源为酵母浸膏和硝酸铵的混合氮源；在装料100mL的250mL三角摇瓶中于32℃、120rpm振荡培养40-44h后，发酵液中木聚糖酶活力高达3839.5Iu/mL，具有工业开发前景。     

用于生产低聚木糖的木聚糖酶菌株筛选

比较分别属于木霉属(Trichoderma)、毛壳属(Chaetomium)、黑曲霉属(Asperjgillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)的12个菌株的木聚糖酶活性,以蔗渣木聚糖为底物,分析不同菌株木聚糖酶水解产物中的糖类组成,考察木聚糖酶系的稳定性。结果表明,毛壳属菌株所产木聚糖酶的水解产物中,低聚木糖的比例普遍高于其它类型菌株,其中球毛壳AS3．3601不仅木聚糖酶的活性较高,而且酶系稳定性最好,水解液中木二糖、木三糖占总糖含量的76％以上。球毛壳AS3,3601的发酵液按最大剂量0．4ml／10g给小鼠灌胃,每天1次,连续7d,所有受试小鼠均无中毒反应,初步认为球毛壳AS3．3601对于口服是安全的。     

谷胱甘肽合成酶的克隆与工程菌筛选

运用分子生物学方法构建含GSH基因的质粒pGEX4T-1-GSH,转化不同的宿主菌(JM109,DH5α,XBlue,BL21),挑克隆,经重组鉴定(PCR方法),IPTG诱导,检测不同菌间GSH表达产量差异,同时将同种菌部分进行非IPTG诱导对照,比较表达量差异,旨在寻找高表达GSH活性菌。结果显示,质粒pGEX4T-1-GSH重组转化JM109,DH5α,XBlue,BL21,经IPTG诱导后,GSH的产量在BL21中较高,表明BL21可以是GSH的高表达菌株。     

利用ITS-RFLP标记辅助筛选白灵侧耳与杏鲍菇杂交菌株

为提高白灵侧耳菌株、杏鲍菇菌株及其杂交菌株筛选效率及鉴定的准确性,利用ITS-RFLP标记辅助单核杂交技术对白灵侧耳与杏鲍菇的杂交菌株进行了筛选.对5份白灵菇菌株和4份杏鲍菇菌株进行了种间配对杂交,根据亲本菌株交配型将其分成7个组合进行杂交.结果表明:9份亲本材料共具有6个A因子和7个B因子.利用该技术对杂交处理后的菌株样品进行筛选,获得了3份杂交菌株11D、53D、70D,其中杂交菌株11D与53D的菌丝生长速度与亲本菌株相比较差异显著;杂交菌株70D的菌丝生长速度与亲本菌株XB130DB相比较差异显著,而与亲本菌株BL130DB在菌丝生长速度上差异不显著.     

基于Riboswitch的细胞与门构建

利用Riboswitch调控原理, 在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中构建一个细胞与门。该与门以实验室常见的阿拉伯糖和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为输入信号, 黄色荧光蛋白YFP为输出信号, 流式细胞仪检测结果显示该细胞与门成功地实现与逻辑运算。该与门利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株的特性, 减少了基因线路的负载。此外, 该与门还具有可复用的特点。     

棒曲霉Ac－22β－木聚糖酶合成的调控

棒曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｌａｖａｔｕｓ）Ａｃ－２２β－木聚糖酶的合成被木糖、木聚糖和含木糖苷的物质所诱导，而受葡萄糖、果糖、甘露糖和蔗糖等易利用的碳源阻遏，但它可产生部分组成型木聚糖酶，蛋白质合成抑制剂环已亚胺及呼吸抑制剂叠氮化钠、碘乙酸强烈抑制β－木聚糖酶的合成．     

基于基因组的TEV蛋白酶的高表达

TEV蛋白酶由于其高酶切活性、酶切位点的专一性和酶切条件的宽容性而在蛋白分离和蛋白质组学研究等领域有着广泛的应用.目前获得TEV蛋白酶的方法是将克隆在质粒上的TEV基因在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中实现过表达.但本方法有一定缺点,如需使用抗生素,这就可能在后续的纯化中引入杂质,菌株群体中不均一性而降低产量等.本研究通过重组工程方法将受T7强启动子驱动的,与麦芽糖结合蛋白MBP融合的TEV蛋白酶基因整合至BL21(DE3)的基因组上进行过表达.MBP-TEV在细胞内自剪切获得分离的TEV.NiNTA亲和层析得到纯化的TEV,产量可达4.2 mg/L.所分离的TEV表达出良好的酶切活性.本菌株有着以之大规模获得TEV的潜力,所建立的通过重组工程将外源基因整合至BL21(DE3)基因组的进行表达的方法也可成为通用的平台技术.     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达及重组酶性质测定

将不含信号肽的瑞氏木霉内切葡聚糖酶II(Cel5A)的cDNA克隆到pET-28a(+)表达质粒上,与其N末端6个组氨酸标签序列融合,构建成pET-28a(+)-egl2表达质粒,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达.利用低温诱导策略,成功表达出活性重组蛋白.Western blot 结果显示重组Cel5A相对分子分量大约为43 000.进一步对重组Cel5A进行Ni-NTA亲和层析柱纯化并对其进行酶学性质测定,结果显示以羧甲基纤维素钠为作用底物时重组酶最适作用pH为4.5,最适作用温度为60℃;重组酶热稳定性较好,在65℃及以下保温1.5 h,活性仍相当稳定.Mn2+对Cel5A的酶活有促进作用,Fe3+和Cu2+有抑制作用,其它金属离子和EDTA对酶活没有明显影响.底物特异性研究表明,重组Cel5A只能水解混合键葡聚糖和羧甲基纤维素钠,对混合键葡聚糖的水解能力是其对羧甲基纤维素钠水解能力的6.7倍,但对微晶纤维素、Glass microfiber filters、木聚糖、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖没有水解作用.     

聚糖对绿色木霉木聚糖酶的吸附规律

研究了绿色木霉木聚糖酶在微晶纤维素、燕麦木聚糖表面的吸附规律。结果表明:燕麦木聚糖、微晶纤维素对该酶的等温吸附曲线分别与Langmuir吸附模型相吻合,相对应的最大吸附量分别为88.9、32.4 U/g,与微晶纤维素相比,燕麦木聚糖对木聚糖酶的亲和能力较强。木聚糖酶在这两种聚糖上吸附过程可用一级动力学方程来描述,木聚糖酶在燕麦木聚糖上的吸附速率常数比它在微晶纤维素上的吸附速率常数大35%。对电泳图谱和米氏常数的分析表明,燕麦木聚糖和微晶纤维素所吸附组分基本相同。因此,对绿色木霉木聚糖酶而言,燕麦木聚糖为良好的亲和吸附剂。     

黑蛋巢菌属和红蛋巢菌属真菌的5种水解酶活性测定

通过测定黑蛋巢菌属9个菌株和红蛋巢菌属6个菌株的几丁质酶、β-1, 3葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和木质素过氧化物酶共5种水解酶活性,为评价和合理利用鸟巢菌资源提供依据。结果表明,所有菌株均具有以上水解酶活性,同一种水解酶的活性在不同菌株之间以及同一菌株的不同水解酶活性差异显著。其中红蛋巢菌134表现出最大的几丁质酶活性,达到122.1 U/mL;黑蛋巢菌24的β-1, 3葡聚糖酶活性最强,达到143.7 U/mL;在25℃下培养,黑蛋巢菌185的纤维素酶活性最高,达到62.3 U/mL,35℃下培养,菌株185的纤维素酶活性也最高,达到了137.6 U/mL,所有菌株的纤维素酶活性在35℃培养4周比25℃培养2周要高;在25℃下培养时,菌株134的木聚糖酶活性最高,达到了464.8 U/mL,35℃培养4周时,菌株185具有最高的木聚糖酶活性,达到了745.6 U/mL,总体上木聚糖酶的活性在35℃培养4周高于25℃培养3周;黑蛋巢菌150表现出最高的木质素过氧化物酶活性,为0.297 U/mL。总体比较,菌株185的复合酶系较发达,有望利用该菌株完成植物秸杆的降解及利用。