CO_2对药材甲和烟草甲幼虫能源物质利用相关指标的影响

昆虫的能源物质在其抵御不良环境时发挥着重要作用,为探明药材甲Stegobium paniceum和烟草甲Lasioderma serricorne幼虫在CO_2处理下对能源物质的利用差异,本研究采用不同φ(CO_2)(10%、30%、50%、70%和90%)对其分别胁迫2、4、6、8 h后,测定其体内多糖、可溶性蛋白质及脂肪等能源物质的含量变化,比较了两种昆虫幼虫对不同能源物质的利用率。结果表明,同一φ(CO_2)胁迫下随着时间的延长,或者相同胁迫时间下随着φ(CO_2)的升高,两种昆虫幼虫的能源物质含量均逐渐降低。在φ(CO_2)=90%条件下,两种昆虫幼虫的各能源物质含量均最低,药材甲幼虫的多糖、可溶性蛋白质及脂肪含量分别为13.75,165.42和37.25μg/头;烟草甲幼虫分别为14.87,176.14和38.49μg/头。不同φ(CO_2)条件下,两种昆虫幼虫对不同能源物质具有相似的利用规律,均为多糖脂肪可溶性蛋白质,且随着φ(CO_2)的升高,其利用率显著降低。相同φ(CO_2)条件下,两种昆虫幼虫对可溶性蛋白质的利用率无显著差异,但药材甲对多糖和脂肪的利用率均显著低于烟草甲。因此,φ(CO_2)显著影响药材甲和烟草甲幼虫体内的多糖、可溶性蛋白质及脂肪等能源物质,CO_2气调保存中药产品过程中可通过影响这些昆虫生理指标达到控制害虫的目的。     

马铃薯乙醇酸氧化酶StGLO1对模拟水分胁迫的响应

为了解乙醇酸氧化酶在调控植物生长代谢及生物与非生物胁迫过程中发挥的作用。本研究以‘青薯9号’马铃薯为材料克隆乙醇酸氧化酶基因StGLO1,构建过表达载体并转化烟草,观察在干旱胁迫处理下转基因烟草和野生型烟草的长势,并测定了叶片中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量以及转基因根茎叶中StGLO1基因的表达量变化,验证过表达StGLO1烟草在干旱胁迫下的响应。结果表明:StGLO1(GenBank登录号XM_006348318.2)基因CDS为1 116 bp,编码371个氨基酸;干旱胁迫下,转StGLO1基因烟草的生长优于野生型,转基因烟草StGLO1基因的表达量在叶片中最高;转基因烟草中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量高于野生型,达到差异显著水平(P0.05)。该结果为进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱羧酸酯酶基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为396 bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自铜绿蝇、家蝇、沟鼠、黑腹果蝇、线虫和埃及伊蚊的羧酸酯酶的片段存在高度同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,羧酸酯酶基因表达水平明显升高.以上结果表明,羧酸酯酶基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在有毒化学物质解毒及增强褐飞虱对抗性水稻的耐受性方面可能起着重要作用.     

一个麻疯树C2H2型锌指蛋白基因JcZFP1的克隆与表达分析

从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个C2H2型锌指蛋白基因,JcZFP1,全长931bp,开放阅读框全长735bp,编码244个氨基酸残基,等电点pI=7.0,分子量PA=27.38kD.C2H2型锌指结构位于第81至103个氨基酸残基中,包括植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH.在该基因的顺式作用元件上发现了与生长发育和逆境胁迫相关的启动元件.荧光定量PCR(qPCR)检测发现,JcZFP1基因在麻疯树各器官中的表达量依次为:绿果皮花叶根茎种仁,且幼嫩器官表达量高于成熟器官;对麻疯树幼苗进行低温、干旱胁迫时,JcZFP1基因的表达量明显增加,表明该基因可能在麻疯树的生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用.     

高浓度CO2气调对药材甲羧酸酯酶活性的影响

用高浓度CO2气体胁迫处理药材甲Stegobium paniceum（L．）成虫及离体羧酸酯酶,通过终点法测定酶活性及其动力学参数变化,分析气调胁迫对羧酸酯酶性质的影响．结果显示,处理6,9,12h,羧酸醋酶比活力分别为0．412mmol／（mg·min）、0．439mmol／（mg·min）、0．418mmol／（mg·min）,与对照0．358mmol／（mg·min）相比,分别升高了14．96％,22．58％,16．69％,差异均达到显著水平．处理时间延长至15h,比活力降低了2．73％．羧酸醋酶酶液经持续通人高浓度CO2于37℃水液中离体处理10min,比活力显著降低．离体处理亦导致羧酸酯酶动力学参数发生相应变化．     

敌百虫对蚯蚓体内几种解毒酶活性的影响

为了解蚯蚓对有机磷农药敌百虫毒害的抗药性机制,采用滤纸接触法,将不同质量浓度的敌百虫作用于内蒙古赤峰市周边地区蔬菜大棚的蚯蚓,提取相应的解毒酶,用试剂盒和酶标仪等测定酶活性.结果显示:经不同质量浓度的敌百虫处理后,蚯蚓体内的谷胱甘肽转移酶(GSTs)、乙酰胆碱酯酶(ACh E)和羧酸酯酶(Car E)活性均先随着敌百虫质量浓度的增大而增加,达到峰值后,随着敌百虫质量浓度的进一步增大,3种解毒酶的活性下降.敌百虫质量浓度为0.06 g/L时,GSTs活性达到最大;敌百虫质量浓度为0.04 g/L时,ACh E和Car E活性最大,GSTs的活性也较高.     

一个麻风树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定

通过PCR技术克隆得到一个麻疯树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因(JcKTI)的开放阅读框序列(540bp),对应的基因组序列不含内含子.该序列编码一个含有179个氨基酸残基的成熟多肽,其在根和茎中的表达最高,在叶片和种子中较低.原核表达的重组蛋白显示出一定的抑制牛胰蛋白酶的活性,过表达该基因的转基因烟草蛋白提取物对胰蛋白酶具有一定抑制作用,同时转基因烟草叶片可使进食后的棉铃虫幼虫生长发育受阻,摄食量减少.上述结果暗示JcKTI基因可能在麻疯树根和茎的抗虫应答中扮演着一定的角色.     

复苏植物牛耳草BhLEA2基因启动子的分离和基因表达模式研究

为研究干旱诱导的基因表达模式,利用Inverse-PCR和Tail-PCR的方法从复苏植物牛耳草（Boea hygrometrica（Bunge）R Br．）中扩增出胚胎发育晚期丰富蛋白编码基因BhLEA2的1215bp启动子序列,命名为PBhLEA2。构建了由PBhLEA2启动子引导GUS嵌合基因的植物表达载体pBhLEA2-GUS,并经农杆菌介导导入到烟草中,得到4株转基因烟草植株。GUS检测分析表明,该启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的种子和刚萌发的小苗的子叶和胚轴中高效表达,在10-20d苗龄的植株中不表达,表现出一定的发育阶段和组织特异性。干旱、高盐胁迫及脱落酸（ABA）、乙烯和H2O2等信号分子可在不同程度上诱导GUS报告基因在20d苗龄的转基因植株的叶片中表达,但只有ABA可诱导其在根中表达,表明该启动子对BhLEA2基因表达的调控受环境信号影响。     

过量表达脯氨酸的转基因烟草细胞对毒性重金属的抗性增强

脯氨酸(Proline)在植物对环境胁迫的耐受性中发挥了非常重要的作用。本文中,我们将来自飞蛾豆(V igna acon itifolia L.)的△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(△1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)基因转化烟草(N icotiana tabacum cv SR I.),经PCR扩增及Southern杂交分析证实飞蛾豆p5 cs基因已整合到烟草细胞基因组中,并在转基因烟草中得以表达。与野生型细胞相比,转基因烟草细胞中脯氨酸含量提高了80%;在毒性重金属镉(Cd,浓度50-100μM)的胁迫下,转基因细胞的生长速度更快,与镉结合的能力也提高近4倍。还原型/氧化型GSH之比和丙二醛水平分析表明,转基因细胞脯氨酸的增加与GSH的氧化还原状态和丙二醛水平是有关的。     

柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。     

柽柳ThPR1基因的克隆与表达分析

通过对盐胁迫后刚毛柽柳(Tamarix hispida)7个转录组分析,鉴定获得病程蛋白相关基因PR1(命名为ThPR1)全长cDNA序列,该基因全长756 bp,编码区长537 bp,编码含178个氨基酸的蛋白质,分子质量为20.53 ku,理论等电点(pI)为9.75。为了研究该基因对逆境胁迫的应答情况,采用实时定量RT-PCR技术分析了刚毛柽柳在PEG、NaCl胁迫及外源ABA处理后不同组织中基因的表达。结果表明,NaCl会诱导ThPR1基因在根和叶中的表达,而PEG和ABA处理则抑制该基因在根和叶中的表达。     

基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因(OSIPA)启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统,水稻Os GA3ox2(D18)启动子驱动水稻Os GA2ox1基因,玉米Ubiquitin启动子驱动BAR::GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab基因复合性状植物表达载体p GM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,获得了43株转基因烟草植株。结果表明,水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度,但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性,可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片,发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究,发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%,其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%~99.97%之间。     

正交试验法确定烟草甲成虫羧酸酯酶反应的最适条件

应用正交表L25(56)设计正交试验,研究了羧酸酯酶质量浓度、体积分数浓度、反应体系的pH值、反应温度和反应时间等5个因素对烟草甲成虫羧酸酯酶活性检测的影响,并从试验组合中选出最佳条件.在进行极差分析、方差分析和多重比较后,选择各因素的最优水平,得到了烟草甲成虫羧酸酯酶活性测定的最适条件,即酶的质量浓度为1头/mL、底物的体积分数为5.0×10-4 mo1/L,pH值为7.5,温度为42℃,时间为10 min.     

Flotilin-1在黑腹果蝇不同发育阶段的表达

脂筏(Lipid raft)是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂以及特定蛋白的微结构域,浮舰蛋白-1(Flotillin-1)是脂筏标记蛋白,与轴突再生、学习记忆和肿瘤形成等过程相关.近年发现,从无脊椎动物到脊椎动物的很多种类都有Flotillin-1的表达,且在进化上高度保守.果蝇属于完全变态昆虫,是一种重要的模式生物,含有人类疾病相关基因中65%同源基因.因此,研究这些基因在果蝇不同发育阶段的表达分布特征,对深入阐明人体病理机制具有重要意义.以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)为研究对象,通过Western blot和免疫荧光方法检测Flotillin-1在果蝇不同发育阶段的表达.结果如下:Flotillin-1在果蝇不同发育阶段的表达水平和分布不同:幼虫期仅脂肪体中少量表达;蛹期消化道和脂肪体中有少量表达;成虫期主要在脑、复眼、消化道、生殖腺中表达,肌肉中也有少量表达;该蛋白在成虫中的表达量显著高于幼虫和蛹.     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

Th2CysPrx基因提高酿酒酵母多种胁迫耐受性研究

【目的】过氧化还原蛋白是生物体调节体内氧化还原系统的一种重要蛋白质,在植物生长代谢中起重要作用。前期研究发现过表达刚毛柽柳Th2CysPrx基因的烟草和柽柳中4种抗氧化酶基因(ThGSTZ1、ThGPX、ThSOD和ThPOD)的表达水平上调, 转基因植株的NaCl胁迫耐受性提高。本实验探究Th2CysPrx基因除了响应NaCl胁迫应答,是否还参与其他盐胁迫和其他胁迫的应答。 【方法】将Th2CysPrx构建到pYES2酵母表达载体上,转化到酿酒酵母INVSC1细胞中,分析比较重组酵母(pYES2-Th2CysPrx)和对照酵母(pYES2)细胞在各种非生物胁迫后的生长情况。【结果】过表达Th2CysPrx基因的重组酵母细胞在低温、KCl和LiCl胁迫后存活率与对照相比差异不显著;但H₂O₂、NaCl或NaHCO₃胁迫后酵母细胞的存活率显著提高。此外,高于0.5 mol/L山梨醇或高温(达到44 ℃),或低于质量分数0.007% CdCl₂胁迫后,过表达Th2CysPrx基因能显著提高重组酵母的细胞存活率。【结论】Th2CysPrx基因可以显著增强酵母细胞对NaCl和NaHCO₃胁迫的耐受能力,以及特定的渗透胁迫、高温胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫的耐受能力,但对低温、KCl和LiCl胁迫耐受能力无明显影响。     

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.     

2,5—二甲苯酚的O—烷基化反应

研究了2,5-二甲苯酚与1,3-二卤代丙烷及一卤代羧酸酯的O-烷基化反应.2,5-二甲苯酚与1,3-二溴丙烷在NaOH-H_2O,NaOH-甲苯-DMSO或无水K,CO_3-丙酮中反应,产物均为1-(2,5-二甲苯氧基)-3-溴丙烷,产率分别为59.8%,64.5%和74.0%.2,5-二甲苯酚与1-溴-3-氯丙烷在无水K_2CO_3-丙酮中反应,产物为1-(2,5-二甲苯氧基)-3-氯丙烷,产率为77.5%.上述产物的结构由~1HNMR和IR数据所确定.2,5-二甲苯酚与一卤代羧酸酯的反应产率在81%以上.     

玉米1,3,4-三磷酸肌醇5/6 激酶ITPK家族基因的鉴定和分析

 1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶(ITPK)是一种在动物、植物、线虫中都比较保守的多功能酶, 在生物信号传导及生长发育中起重要作用。为了充分研究玉米中ITPK 家族基因系统分析、全生育期基因表达模式及逆境胁迫表达模式, 利用玉米基因组数据库, 通过生物信息学手段, 鉴定玉米ITPK 家族基因的全序列、定位和编码蛋白, 通过序列比对进行进化和分类分析。利用玉米高通量芯片表达数据进行组织表达差异性、干旱胁迫和病害胁迫表达谱分析。结果表明, 玉米基因组中含有6 个ITPK 家族基因, 分布于玉米的4 条染色体上。MEME 保守结构域分析显示, ZmITPK1-5 均含有3 个保守的ATP-grasp-4 结构域, ZmITPK6 含有两个ATP-grasp-4 保守结构域。进化树分析表明ZmITPK 可分为3 个亚家族。各个发育阶段中, 多数成员在生殖器官或营养器官中均有较高的表达量, 只有ZmITPK1 在所有器官中表达量都不高。ZmITPK2 和ZmITPK3 基因受干旱胁迫处理诱导不同程度上调表达。而在生物胁迫条件下均无显著上调或下调表达。     

杂交鹅掌楸LhARF2基因启动子的克隆及瞬时表达分析

生长素响应因子(Auxin response factor, ARF)参与调控植物生长发育的多个途径。本研究利用Tail-PCR技术从杂交鹅掌楸中克隆LhARF2基因5′端上游2 637 bp序列,即pLhARF2启动子,并利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的调控元件,发现其含有启动子必需元件TATA-box和CAAT-box,以及压力响应、激素响应、光信号转导和代谢循环过程元件。构建pLhARF2-pCAMBIA1300:GUS植物表达载体并瞬时浸染本氏烟草叶片,利用GUS组织化学染色法鉴定烟草叶片中瞬时表达活性,发现在烟草叶片中有蓝色斑块,但颜色较浅。实验结果推测杂交鹅掌楸pLhARF2启动子可以调控GUS基因活性,为下一步研究启动子遗传转化的组织表达活性奠定了基础。