中国红豆杉悬浮细胞固定化培养生产紫杉醇

对海藻酸钠包埋法固定中国红豆杉悬浮细胞的条件进行研究,建立了一套合适的固定化操作条件,即海藻酸钠浓度为３０ｇ／Ｌ,聚乙烯醇（ＰＶＡ）浓度为８０ｇ／Ｌ,ＣａＣｌ２浓度为２０ｇ／Ｌ,包埋密度为０．２ｋｇ／Ｌ,接种密度为０．１ｋｇ／Ｌ．在此基础上,对中国红豆杉细胞固定化培养的培养基进行了优化,结果表明,从红豆杉树皮中分离出的真菌培养物作为诱导物能限制细胞生长,且明显促进紫杉醇合成,并诱导紫杉醇分泌到培养液中．在培养基中适量地添加前体亦能提高紫杉醇的产量．对红豆杉细胞固定化培养中紫杉醇合成与分泌进行了动力学研究．     

真菌诱导物对红豆杉细胞的影响

从红豆杉树皮,根皮中分离得到了十种真菌,由这些真菌制成的真菌诱导物加入到红豆杉细菌培养物中后,均能引起细胸发生过敏反应,细胞生长量下降,增减液ＰＨ值降低     

红豆杉抗真菌细胞株的筛选及生理生化特性

通过胁迫筛选法筛选红豆杉抗真菌细胞变异系,并比较了该细胞系和原型在真菌诱导物处理后与抗病有关的几种酶的变化规律以及紫杉醇含量的变化．结果表明诱导物处理后抗性细胞的紫杉醇含量显著高于原型,并且过氧化物酶（ＰＯＤ）、苯丙氨酸解氨酶 （ＰＡＬ）和超氧阴离子自由基（Ｏ·－２ ）释放速率均与原型有明显区别．     

种子细胞的生长时相和紫杉醇生产的关系研究

处在生长周期不同时相的红豆杉细胞作为种子细胞,接入含来自红豆杉树皮的真菌诱导子的生产培养其中,紫杉醇的生产和种子细胞的生长时相有明显的对应关系。来自对数生长后 稳定前期的细胞,胞内紫杉醇分别为２６．８μｇ．ｇ＾－１和５８．１μｇ．ｇ＾－１;来自稳定后期的细胞对诱导子反应最敏感,     

红豆杉抗真菌细胞株的筛选及生理生化特性

通过胁迫筛选法筛选红豆杉抗真菌细胞变异系,并比较了该细胞系和原型在真菌诱导物处理后与抗病有关的几种酶的变化规律以及紫杉醇含量的变化,结果表明诱导物处理后抗性细胞的紫杉醇含量显著高于原型,并且过氧化物酶（ＰＯＤ）、苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）和超氧阴离子自由基（Ｏ２）释放速率与原型有明显区别。     

代谢途径的调节对紫杉醇生物合成的促进作用

通过采用一些代谢调节剂,研究了红豆杉细胞中一些初生代谢途径以及甲瓦龙酸（ＭＶＡ）途径与紫杉醇生物合成的关系,并对这些调节剂的协同作用进行了工艺研究．结果表明,第１５ｄ加入１００ｇ／Ｌ黄豆芽提取液、１００ｍｇ／Ｌ丙二酸钠和６．２ｍｇ／Ｌ硼酸,或第１５ｄ加入４２．７ｍｇ／ＬＣＣＣ,２５．６ｍｇ／Ｌα－蒎烯及１１．５ｍｇ／ＬＥＧＴＡ,其协同作用都能显著提高紫杉醇的产量．此外,试验结果表明真菌诱导物对细胞的影响与Ｃａ离子通道变化引起的信号传导有关．     

种子细胞的生长时相和紫杉醇生产的关系研究

处在生长周期不同时相的红豆杉细胞作为种子细胞,接入含来自红豆杉树皮的真菌诱导子的生产培养基中,紫杉醇的生产和种子细胞的生长时相有明显的对应关系.来自对数生长后期和稳定前期的细胞,胞内紫杉醇含量分别为26.8μg·g-1和58.1μg·g-1;来自稳定后期的细胞对诱导子反应最敏感,紫杉醇含量比来自延迟期和对数生长初期的细胞中的紫杉醇含量提高了两个数量级,达421μg·g-1.     

几种释放因素对紫杉醇合成与释放的影响

比较研究了几种释放因素对红豆杉细胞生长和紫杉醇合成与释放的影响,结果表明,在中国红豆杉细胞悬浮培养过程中,在细胞生长对数期（14d)加入φ＝5％二甲亚砜及0．2mol/L甘露醇,能显著提高紫杉醇的合成及释放,紫杉醇总产量达到16mg/L,在细胞生长在对数期（14d)加入0．04mol/L氯化钠时,紫杉醇总产量达到7．3mg/L,在细胞生长对数期（14d）加入2mg/L硫酸铈铵时,紫杉醇总产量达到24mg/L。     

红豆杉细胞聚集体悬浮培养生产紫杉醇

建立了中国红豆杉(Taxuschinensis)细胞聚集体两步法悬浮培养生产紫杉醇的培养体系.红豆杉细胞于含LH1g/L,NAA0.1mg/L,2,4-D0.5mg/L及6-BA0.8mg/L的细胞聚集体形成的培养基中生长并形成聚集体,10d后转入生产培养,较大细胞聚集体的生物量比和紫杉醇产量分别较对照组提高了53.7%和82.1%;提高细胞聚集体的生物量比能显著增加紫杉醇产量.四种基本培养基中B5最适合诱导细胞聚集体的形成.生长培养12d后细胞悬浮培养物按1∶1(体积比)直接转入生产培养对细胞生长、细胞聚集体和紫杉醇形成最有利.在100μmol/L茉莉酸甲酯作为诱导子下本体系紫杉醇产量较对照组提高了一倍.     

不同诱导子对曼地亚红豆杉内生真菌产紫杉醇的影响

从曼地亚红豆杉树皮中分离得到1株链格孢属(Alternaria sp.)内生真菌MF5。初期马铃薯葡萄糖(PD)培养基液体培养结果显示,MF5的发酵产物中检测到的紫杉醇质量浓度约为0.58 mg/L。为了提高MF5发酵产物中紫杉醇含量,考察添加CuSO_4、茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA_3)和红豆杉浸出液对MF5产紫杉醇的影响。结果表明:添加4%红豆杉浸出液,对MF5进行发酵培养,发酵产物中紫杉醇质量浓度为(2.47±0.07) mg/L;在此基础上,添加CuSO_4、MeJA、GA_3 3种诱导子也能够提高MF5产紫杉醇的能力,且同时添加3种诱导子时,MF5发酵物中紫杉醇含量最高,达到(12.58±0.80) mg/L。本研究证实了3种诱导子和红豆杉浸出液均可促进内生真菌代谢产生紫杉醇,为后续真菌发酵法生产紫杉醇打下基础。     

红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展

综述了近年来红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展, 包括红豆杉细胞培养生产紫杉醇的代谢调节、无机盐、植物生长调节因子、糖分及其它因素对红豆杉细胞生长和紫杉醇生产的影响等.着重介绍了前体饲喂、添加抑制剂和添加诱导子对红豆杉细胞生长及紫杉醇生产的影响.     

不同培养方式的红豆杉细胞悬浮培养比较研究

进行了批式培养与补料批式培养下的细胞生长及紫杉醇合成动力学比较研究，并优化了红豆杉细胞补料批式培养条件。在批式培养过程中紫杉醇合成在24d达到最大，为4.3mg/L。补料批式培养延长了细胞的生长时间，大幅度提高了细胞干重及紫杉醇的含量。培养条件优化后，最高紫杉醇含量达至11.3mg/L。     

连续灌注培养红豆杉细胞生产紫杉醇的研究

利用由一圆形柱和三角瓶组成的生物反应器对红豆杉细胞进行连续灌注培养，结果显示，培养基的pH值，糖和磷的变化幅度较平缓，细胞的生长期长，说明该反应器适于细胞生长，根据该反应器具有培养液提取简便的特点，首次提出诱导子可按照培养基中残糖和残磷的体积质量加入，而且发现高含量紫杉醇仅发生在特定的残糖和残磷体积质量下，结果还显示该反应器用于诱导和萃取结合处理细胞，与搅拌式和气升式反应器相比，得到较高的生物量和紫杉醇产量，这些结果表明该反应器可用于连续灌注培养红豆杉细胞生长紫杉醇。     

红豆杉细胞植板方法的研究

在红豆杉细胞植板中,适宜的培养基是优化的ＭＳ培养基,其中ＮＡＡ浓度为０．５ｍｇ／Ｌ,６ＢＡ浓度为０．５ｍｇ／Ｌ;培养细胞生长周期约４０ｄ;培养基中最优碳源浓度是：蔗糖３０ｇ／Ｌ、葡萄糖１０ｇ／Ｌ．无机盐最佳浓度是：ＮＨ＋４１０ｍｍｏｌ／Ｌ,ＮＯ－３４０ｍｍｏｌ／Ｌ,ＰＯ３－４１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ．研究表明,培养基的ｐＨ值与植板率密切相关．氨基酸及维生素等有机成分能明显促进细胞生长．来自细胞悬浮培养物的条件培养基能显著地促进红豆杉培养细胞的单细胞在低密度植板时的克隆形成     

红豆杉组织、细胞培养物紫杉醇快速检测

利用薄层层析，高效液相色谱，酶联免疫吸附等方法对国内4种1变种红豆杉及其组织，细胞培养物进行紫杉醇快速定性，定量检测，试验结果表明，国内4种1变种红豆杉及其组织，细胞培养物中都含有紫杉醇，其中东北红豆杉及其培养物中紫杉醇含量较高。     

红豆杉胚源细胞株的培养和紫杉醇的生产

研究了建立适用于紫杉醇生物合成的红豆杉 ( Taxus chinensis)胚源细胞株的方法 .红豆杉成熟种子 ,用自来水冲洗 9d,培养 1 0 d,萌发率可达 1 0 0 %.已萌发的种胚在诱导培养基中培养 6d,愈伤组织的诱导率达 1 0 0 %,使用红豆杉茎源细胞株看护培养诱导出的愈伤组织使愈伤组织的继代成活率提高一倍 .红豆杉茎源细胞株生长 1 5d的条件培养液也能使愈伤组织继代成活率提高 60 %.对建立的胚源细胞株进行了筛选和培养 ,其中细胞株 E2和 E3生长快 ,紫杉醇含量也较高     

活性炭及Vc对红豆杉细胞培养的影响

添加活性炭 ( AC)、抗坏血酸 ( Vc)于红豆杉细胞培养基中 ,发现 0 .0 8%的 AC、高浓度的 Vc对红豆杉细胞生长有促进作用 ,其过氧化物酶活性强 ,鲜重比大 ,而多酚氧化酶活性弱 ,褐变强度小 ,褐变等级低 .     

前体和诱导子对紫杉醇合成影响的优化研究

用响应面方法对红豆杉细胞培养生产紫杉醇的几种前体及诱导子进行了优化，首先，用部分因素实验对苯丙氨酸，脱落酸，硝酸银，苯甲酸钠，醋酸钠，壳聚糖，甘氨酸对紫杉醇含量的影响进行评价，并找出其中主要影响因子壳聚糖，硝酸银和脱落酸；其次，用最速上升法逼近最大响应区，最后用中心组合设计和响应面分析确定主要影响因子的最适浓度，经优化后的紫杉醇体积质量达到60．5mg/L，较优化前提高1倍，利用以上结果进行5L反应器放大培养，紫杉醇体积质量达54．6mg/L。     

非小细胞肺癌细胞A549对紫杉醇耐药机理研究

目的利用非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol,研究其对紫杉醇耐药性的分子机理.方法通过长时间低浓度的紫杉醇处理A549细胞的方法获得其耐药细胞株A549/taxol,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR观察其凋亡基因的表达情况,并通过不同siRNA处理细胞进行基因沉默,研究其在不同遗传背景下对紫杉醇的耐受情况.结果发现非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol的基因表达紊乱,表现为ING5的高表达抑制了凋亡基因Bcl-2的表达水平,而Bcl-2是紫杉醇诱导细胞凋亡所必需的.结论以上结果初探了A549对紫杉醇耐药性的机制,为探寻紫杉醇化疗新策略提供了新的思路.     

悬浮培养红豆杉细胞中影响细胞生长和紫杉醇产量若干因素的研究进展

综述了悬浮培养红豆杉细胞生长状态、植物生长调节因子、糖分、氨基酸、无机盐、ｐ Ｈ值及光照等因素对细胞悬浮培养生产紫杉醇的作用,为探索生产紫杉醇的最适条件和大规模细胞培养（生产紫杉醇）提供理论依据