红皮云杉体胚发生体系优化和超低温保存技术研究

【目的】通过对红皮云杉(Picea koraiensis)体细胞胚胎发生条件的筛选和超低温保存技术研究, 建立其完整的体胚发生体系及超低温保存条件,为红皮云杉优良种质资源的大量繁殖及保存提供基础。【方法】以红皮云杉合子胚为外植体,以两种基本培养基、6种植物生长调节剂组合为培养条件,筛选胚性愈伤组织诱导的适宜条件。并将获得的胚性愈伤组织进行超低温保存和体胚发育与成熟萌发试验,以3种脱落酸(ABA)和Gelrite浓度以及4种基本培养基为培养条件,筛选出体胚成熟和萌发的适宜培养条件。【结果】①两种基本培养基相比较,改良RJW(诱导率为30.00%)优于1/2 LV(诱导率为22.50%)基本培养基。当萘乙酸(NAA)质量浓度为3.0 mg/L、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)质量浓度为0.5 mg/L时胚性愈伤组织诱导率最高为50.00%;② 胚性愈伤组织增殖培养3个月后进行超低温保存试验,经恢复培养10 d 左右可以清晰地观察到成活的胚性愈伤组织,3个细胞系的胚性愈伤组织均可成活;③ 体胚发育阶段,改良RJW培养基添加Gelrite 6.0 g/L和ABA 20 mg/L时,3个细胞系体胚数量均较高,但是畸形胚比例也偏高,特别是HY-1细胞系畸形胚比例高达77.14%;当Gelrite质量浓度增加到8.0 g/L时,3个细胞系畸形胚比例均降低, 其中HY-2细胞系体胚数量为396.00个/g,畸形胚比例为10.33%;④ 红皮云杉体胚成熟培养两个月进行体胚萌发,在1/2 LM上体胚萌发能力最弱,其次是LM基本培养基,改良RJW体胚萌发能力最佳。不同细胞系体胚萌发能力也不同,体胚萌发能力最高为65.00%。【结论】① 胚性愈伤组织诱导的适宜培养基为改良RJW基本培养基,适宜的激素组合为NAA 3.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L;② 本试验进行超低温保存的细胞系均可成活;③ 体胚发育与成熟适宜的ABA质量浓度为20 mg/L,适宜Gelrite质量浓度为8.0 g/L;④ 体胚萌发的适宜基本培养基为改良RJW基本培养基。本研究建立了红皮云杉体胚发生体系并成功进行胚性愈伤组织的超低温保存条件,该技术体系可用于红皮云杉优良种质的快速繁殖。     

不同活性炭对杂交鹅掌楸体胚发生的影响

活性炭在体胚发生过程中能够促进细胞的生长及发育。为进一步提高杂交鹅掌楸体胚发生效率,以两个基因型的杂交鹅掌楸愈伤组织为材料,在培养过程中添加磷酸碳、针剂碳和Sigma公司活性炭,通过统计体胚总数及子叶胚数量,测定培养基的pH和渗透压,分析活性炭的吸附性能等,以筛选适合杂交鹅掌楸体胚发生的活性炭类型,并探索不同活性炭影响杂交鹅掌楸体胚发生效率差异的原因。研究结果表明:针剂碳、磷酸碳处理下诱导获得的杂交鹅掌楸体胚总数和子叶胚数显著高于Sigma公司活性炭,且针剂碳的效果最佳。针剂碳的吸附性能适中,添加针剂碳的培养基高压灭菌后其pH和渗透压也适中,说明活性炭的吸附性能会影响培养基的pH和渗透压,从而影响杂交鹅掌楸的体胚发生。     

暴马桑黄GPS基因克隆及响应茉莉酸甲酯诱导表达研究

【目的】对参与暴马桑黄(Sanghuangporus baumii)三萜合成途径的关键酶牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)基因进行克隆及诱导表达分析，以期深入探究暴马桑黄三萜合成分子机理。【方法】采用PCR扩增技术克隆暴马桑黄GPS基因cDNA全长及启动子，利用生物信息学软件对序列进行分析；采用qRT-PCR技术分析不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)对暴马桑黄GPS基因转录水平的影响，并用分光光度计测定不同浓度MeJA诱导下暴马桑黄三萜含量的变化。【结果】将克隆得到的暴马桑黄GPS基因和启动子分别命名为SbGPS和SbGPS启动子。基因分析发现SbGPS基因cDNA序列全长1 617 bp,共编码538个氨基酸，没有信号肽和跨膜结构。SbGPS启动子分析结果显示，除了含有CAAT-box、TATA-box等典型的启动子作用元件，还含有茉莉酸甲酯响应元件。荧光定量分析及三萜含量测定结果表明，SbGPS基因表达和三萜含量均随着MeJA浓度增加而呈现出先上升后下降的趋势，并且二者变化趋势基本一致，呈显著正相关。【结论】通过对SbGPS基因的克隆及诱导表达分析发现，该基因在暴马桑黄三萜生物合成途径中具有...     

抗松材线虫病马尾松体胚发生与植株再生条件的优化

【目的】为使抗松材线虫病马尾松(Pinus massoniana Lamb.)快速大规模繁殖,对抗性马尾松体细胞胚胎发生和植株再生条件进行优化。【方法】以抗病马尾松未成熟合子胚为材料,探讨胚性愈伤组织的诱导、增殖与维持、分化成熟以及萌发的合适培养条件,并对体细胞胚进行生根诱导,对再生植株进行壮苗培养以及驯化移栽。【结果】以LP为基本培养基,添加2.0 mg/L 2,4-D(二氯苯氧乙酸)和1.0 mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤),抗性马尾松胚性愈伤组织诱导率最高达27.8%。在胚性愈伤组织增殖维持过程中,悬浮培养中的增殖系数和同步化程度都显著高于固体培养,且经过悬浮培养的细胞系分化能力更强。萌发过程中只有少量能顺利分化出根系,未能顺利分化出根的体胚于添加适量 IBA和 NAA的生根培养基中能够更好地生根。壮苗培养过程中,添加0.01 mg/L油菜素内酯有助于体胚苗的生长。体胚苗在驯化移栽时不同大小的苗移栽成活率相差较大,5 cm左右的体胚苗成活率最高达90.3%。【结论】生长素2,4-D和6-BA组合(2.0 mg/L和1.0 mg/L)对抗性马尾松胚性愈伤组织诱导率较好; 悬浮培养后的细胞系更利于诱导体胚,适宜浓度的IBA和NAA(1.0 mg/L和0.2 mg/L)能够促进体胚苗根系生长。在壮苗培养基中添加适量油菜素内酯能够促进抗性马尾松再生植株的生长,待苗长至5 cm左右移栽较好。     

薄荷MhWRKY57基因克隆及响应茉莉酸信号的表达分析

【目的】分析薄荷转录因子MhWRKY57的基因和氨基酸特性、亚细胞定位、转录活性、组织表达及茉莉酸甲酯处理下的基因表达水平,为揭示MhWRKY57响应茉莉酸信号调控薄荷精油合成的分子机制提供理论依据。【方法】 利用薄荷转录组数据,采用RT-PCR方法获得MhWRKY57基因编码序列,利用生物信息学分析其基因和氨基酸特性,烟草叶片瞬时表达系统进行亚细胞定位,酵母双杂交系统分析转录激活活性,实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)技术分析MhWRKY57基因在各组织及茉莉酸甲酯诱导下的表达模式。【结果】 获得薄荷MhWRKY57基因的编码序列(CDS),编码276个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,含34个磷酸化位点,属于非跨膜亲水蛋白,定位于细胞核且具有转录激活活性。系统进化分析表明,薄荷MhWRKY57与大豆Glyma.01G056800.2.p亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明,MhWRKY57基因在幼叶、成熟叶、花、茎、根中均表达,在根和叶中均明显受到茉莉酸甲酯诱导表达。【结论】 MhWRKY57是一个响应茉莉酸信号的转录因子,可能参与茉莉酸信号介导调控的薄荷精油合成过程。     

红松成熟胚愈伤组织诱导外植体选择及培养条件优化

【目的】通过培养条件的优化和适宜外植体类型的筛选,解决红松成熟胚愈伤组织诱导中存在的愈伤组织诱导率低、生长状态差、褐化率较高等问题,为建立红松成熟胚体胚发生体系奠定基础。【方法】用5种培养基类型、3种蔗糖浓度和9种植物生长调节剂组合,选择8种来源于成熟种子不同部位的外植体,对愈伤组织诱导的培养条件和适宜外植体类型进行优化和筛选。【结果】① 在5种培养基中,DCR培养基上愈伤组织诱导率高于其他培养基、生长状态好于其他培养基; ② 添加在DCR中的3种蔗糖浓度中,35 g/L时的愈伤组织诱导率最高(92.01%)、褐化率最低(17.01%); ③ DCR添加35 g/L蔗糖情况下,9种植物生长调节剂组合中NAA 2.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L组合的愈伤组织诱导率最高、褐化率最低、生长状态最佳; ④ 在选出的优化培养条件下,8种来源外植体中,从裸胚上切离的下胚轴的愈伤组织诱导率高、褐化率低,且增殖能力强,具备胚性愈伤组织的形态解剖特征。【结论】红松成熟胚愈伤组织诱导的优化培养条件为DCR +蔗糖35 g/L + NAA 2.0 mg/L+ 6-BA 1.5 mg/L,适宜外植体裸胚上切离的下胚轴。     

银杏胚乳不同发育时期生理代谢变化与其胚性感受态的相关性研究

【目的】探究银杏胚乳发育时期生理变化与其胚性感受态之间的关系,筛选出高感受态的银杏胚乳外植体,为开展银杏体细胞胚发生的研究及建立银杏体胚发生体系提供支持。【方法】以6月10日—9月15日不同时间段的银杏胚乳为材料,研究各时间段银杏胚乳的抗氧化酶活性、可溶性蛋白、黄酮、内源激素含量变化及与其愈伤组织诱导率的相关性。【结果】银杏胚乳发育及其胚性感受态可以分为3个阶段:第1阶段为6月10日—6月30日,此时胚乳虽然细胞生理代谢旺盛,含水率和超氧化物歧化酶(SOD)活性较高,吲哚乙酸(IAA)与脱落酸(ABA)比值较高,易诱导愈伤组织,但其愈伤组织为松散易褐化的非胚性愈伤组织,胚性感受态水平较低。第2阶段为6月30日—8月10日,期间的胚乳抗性酶活性、黄酮含量、IAA与ABA比值都处于较低水平,而玉米素核苷(ZR)+异戊烯基腺苷(iPA)与ABA的比值处于较高水平;第3阶段为8月17日—9月15日,其胚乳可溶性蛋白含量以及过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性较高,黄酮含量达到峰值,IAA与ABA的比值处于较高水平,且ZR+iPA与ABA的比值处于较低水平,胚性感受态水平高,胚性愈伤组织发生率最高。第2阶段愈伤组织诱导率比第1和第3阶段都低,胚性感受态也较第3阶段低。【结论】3个不同阶段胚乳发育时期胚性感受态强弱和胚性愈伤组织诱导能力的排列顺序为第3阶段>第2阶段>第1阶段,7月20日—9月15日的胚乳胚性感受态较高,是诱导胚性愈伤组织较好的时期。     

茉莉酸甲酯对西伯利亚百合茎尖脱毒试管苗生理特性的影响

以西伯利亚百合为材料,研究了茉莉酸甲酯处理对试管苗成活率、幼苗叶片中POD、SOD、CAT活性和脯氨酸、丙二醛、总酚含量的影响.结果表明:低浓度的茉莉酸甲酯(0.5～1μmol·L-1)能较为有效的提高外植体的成活率,用浓度的茉莉酸甲酯处理试管苗后叶片中POD、SOD、CAT的活性和脯氨酸的含量均有所增加,而丙二醛和总酚的含量较对照有所下降;高浓度的茉莉酸甲酯(2～3 μmol·L-1)则对试管苗的生长有明显的抑制作用,尤其当MeJA浓度达到3μmol·L-1时对试管苗的抑制作用最强,总体上用浓度的茉莉酸甲酯处理试管苗提高试管苗的抗逆性.     

3个白桦细胞色素P450基因生物信息学及表达分析

【目的】研究白桦细胞色素P450基因表达的组织特异性,以及在茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA₃)、脱落酸(ABA)、乙烯利和伤害处理下的基因表达模式。【方法】筛选白桦转录组,获得3个BpCYP450 基因,分别命名为BpCYP4、BpCYP5、 BpCYP14,利用生物信息学分析BpCYP450蛋白的分子结构特征及其与其他物种CYP450蛋白的亲缘关系。采用QRT-PCR技术,对白桦BpCYP450组织特异性、激素信号及伤害诱导下的表达特征进行分析。【结果】生物信息学结果表明BpCYP4、BpCYP5、BpCYP14 cDNA序列长度分别为1 569、1 584和1 530 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),分别编码522、527和509个氨基酸,均为亲水性跨膜蛋白,主要定位于叶绿体。白桦BpCYP450与百脉根、扁豆及豌豆等豆科植物CYP450蛋白亲缘性较高。组织特异性分析结果显示,3个BpCYP450 基因在叶和根中表达较高,茎中较低。激素信号及伤害诱导结果表明,3个BpCYP450基因不同程度地响应MeJA、SA、GA₃、ABA、乙烯利激素信号及伤害诱导。【结论】3个BpCYP450基因均为CYP450基因家族的新成员,具有组织特异性及激素诱导表达特性,可能在白桦生长发育、抵御胁迫及代谢物合成中发挥重要作用。     

茉莉酸甲酯对绿豆下胚轴插条生根的影响

本文研究茉莉酸甲酯对绿豆下胚轴插条生根的效应.将下胚轴基部浸在不同浓度茉莉酸甲酯溶液中24小时,然后砂培发根.结果得知,10~(-8)-10~(-5)mol/L茉莉酸甲酯对绿豆下胚轴产生不定根数无显著影响,但促进根干重增加.10~(-5)-10~(-3)mol/L茉莉酸甲酯显著增加不定根数,但根干重不再增加.因此,低浓度茉莉酸甲酯促进不定根的生长,高浓度茉莉酸甲酯促进不定根的分化.1O~(-8)mol/L茉莉酸甲酯是插条生根的较好浓度.     

鹅掌楸属树种的胚胎学研究进展

目前,鹅掌楸属树种的胚胎学研究可以划分为3 个阶段,即描述胚胎学阶段、比较胚胎学阶段以及实验胚胎学阶段,研究内容涉及了雌、雄配子体的构建,传粉与受精作用的完成,胚与胚乳的发育及种子的形成,性细胞的分离以及未成熟胚的培养等方面。笔者概述了鹅掌楸属树种的一般胚胎学过程与杂交胚胎学的研究结果,以及实验胚胎学的研究进展,并针对鹅掌楸属树种生殖细胞工程和体细胞胚胎发生系统的建立等研究领域进行了展望性的讨论。     

普通油茶体胚再生体系研究

为构建农杆菌介导的油茶遗传转化受体系统,选择普通油茶‘长林'4号、53号和166号的幼胚为外植体材料,进行多因素多水平的组织培养试验。结果表明:培养基的pH对愈伤组织诱导率影响不显著,愈伤组织的诱导率受油茶品种影响极显著; ‘长林'53号的幼胚极易实现胚性愈伤组织诱导和完整植株再生,MS培养基是最佳培养基,2,4-D和TDZ为幼胚较敏感的植物激素,对愈伤组织诱导影响最大; 当MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L TDZ处理时,‘长林'53号体胚诱导率为98%; MS+1 mg/L 2,4-D+2 mg/L KT+500 mg/L CH处理时,‘长林'53号体胚诱导率为89.6%。在不同2,4-D、KT、TDZ和添加物水平的L₉(3⁴)正交试验中,除3个处理外,其他处理组合的‘长林'53号体胚诱导率都达到100%。已分化的胚性愈伤组织在不含任何激素的MS培养基上,可以实现胚状体的萌发、生长及完整植株再生。     

外源激素对防风体细胞胚发生和发育的影响

目的探讨生长素和细胞分裂素对防风体细胞胚发生和发育过程的影响。方法组织培养和石蜡切片。结果0．5mg／L2，4-D是诱导胚性愈伤组织最适宜的生长素浓度，0．5mg／LNAA在胚性愈伤组织的长期继代培养中替代0．5mg／L2，4-D可减少畸形胚的发生，NAA浓度降至0．2mg／L时促进体细胞胚的发生和分化；生长素加一定比例的细胞分裂素(6-BA或KT)可有效促进体细胞胚的发生；通过逐步降低生长素和细胞分裂素的浓度，可促进体细胞胚的分化和生长；体细胞胚在无附加激素或附加激素浓度分别低于0．2mg／LNAA和0．5mg／L6-BA的MS培养基上，均能发育成完整的植株。结论一定浓度的生长素是诱导防风胚性愈伤组织的关键因素，细胞分裂素在体细胞胚的发生和发育过程中起协同作用。     

人参体细胞胚胎发生过程中的生理变化

采用考马斯亮蓝G-250染色法、蒽酮法、愈创木酚法等方法,研究了人参体细胞胚胎发生中可溶性蛋白、多糖及淀粉含量和POD及PPo活性的变化,并对体细胞胚发生的不同时期培养物内源LAA和ABA含量进行了测定.结果表明,多糖和淀粉含量在早期胚时较低,可溶性蛋白含量、POD及PPO活性和IAA含量在早期胚时最高;在成熟胚时期,ABA含量最高,且ABA与IAA的比值在成熟胚时也较高.说明多糖和淀粉参与调节胚性细胞的分化和发育过程,POD及PPO和可溶性蛋白与早期胚形成密切相关;ABA与IAA比值高有利于体细胞胚的发育成熟.     

体外培养时间和表皮生长因子对牦牛卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

研究在成熟液中添加表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）以及成熟时间对牦牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响,以确立牦牛卵母细胞体外成熟的最佳体系.结果表明,成熟液中添加EGF组的成熟率明显高于未添加组（P＜0.05）,并且牦牛卵母细胞的成熟率随着EGF添加的浓度增加也不断上升;随着体外培养时间的延长,成熟率逐渐增加,培养24 h后成熟率趋于稳定;胚胎体外培养液中添加EGF能显著提高孤雌胚胎的8-细胞和囊胚形成率（P＜0.05）.由此推测：在体外培养22-24 h,且添加40 μg/mL EGF最有利于牦牛卵母细胞体外成熟;胚胎培养液中添加40μg/mLEGF能显著提高牦牛孤雌胚胎的体外发育能力.     

碳源对不同产地香樟体细胞胚胎发生及植株再生的影响

【目的】 探究渗透调节物质种类及其不同浓度对香樟体细胞胚胎发生及植株再生的影响,为提高香樟体胚诱导率、优化体细胞胚胎发生体系奠定理论基础。【方法】 以7月初在湖南省郴州、长沙、娄底及怀化市采集的香樟(Cinnamomum camphora L.)的未成熟合子胚为试验材料,分析不同碳源种类、浓度及组合方式对香樟体胚诱导、芽萌发、生根等方面的影响。【结果】 适合香樟的体胚诱导培养基为MS+1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.3 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+1.0 mg/L 链霉素+15 g/L 蔗糖+30 g/L 山梨醇+6.5 g/L 琼脂+700 mg/L水解酪蛋白;增殖培养基为MS+15 g/L 蔗糖+30 g/L 山梨醇+6.5 g/L 琼脂+700 mg/L 水解酪蛋白;芽萌发培养基为MS+0.1 mg/L 苯基噻二唑基脲(TDZ)+0.5 mg/L 萘乙酸(NAA)+0.1 mg/L 吲哚丁酸(IBA)+15 g/L 蔗糖+15 g/L 山梨醇+6.5 g/L 琼脂;生根培养基为MS+1.0 mg/L IBA+15 g/L 蔗糖+15 g/L 山梨醇+6.5 g/L 琼脂。【结论】 经过改良,添加15 g/L蔗糖和30 g/L山梨醇的组合碳源,香樟体胚的诱导率明显提高;添加15 g/L蔗糖和15 g/L山梨醇的组合碳源处理的新植株生根条数多、主根明显,生长状况更优。