松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

专题报道Ⅰ：松材线虫病致病机理与病害防治（执行主编 叶建仁）专题编者按

松材线虫病是在我国发生最严重的毁灭性森林病害,已经在10多个省市区造成了严重的经济和生态损失。该病害原产地为北美洲,自20世纪初先后传入东亚的日本、中国和韩国等,给这些国家的松林带来了巨大的破坏。我国于1982年首次在南京发现松材线虫病,40年来病害一直在不断扩展蔓延。至2021年底,我国有19个省（自治区、直辖市）的728个县级行政区被划分为疫区,当年病死松树达到数千万株,防控形势异常严峻。本专题针对当前松材线虫病流行与防控中的一些热点和难点问题,围绕分子致病机理、疫源追溯和病害防治方法等方面开展研究,通过RNA干扰、基因重组和酵母转化实验明确松材线虫性别分化基因和热激转录因子在生长发育过程中和性别分化中具有的重要作用;以新一代测序技术、分子标记手段研究分析松材线虫在我国的种群分化情况,揭示不同线虫类群与地理区域间呈现的相关性;利用微生物培养、浸渍提取法和生理生化指标测定等方法,筛选并获得一系列对松材线虫具有明显拮抗作用的腐生线虫、松树内生细菌和植物提取物。本专题研究内容有助于深入解析松材线虫病在我国的传播蔓延规律,揭示松材线虫致病关键基因功能,提出病害防控的新方法,从而为更好地防控这一重大外来入侵物种引起的病害提供重要的理论和实践支撑。     

松材线虫与拟松材线虫种间杂交特性研究

选取来自中国、日本和美国的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)4个虫株,以及中国的拟松材线虫(B.mucronatus)2个虫株进行生物学杂交和交配对象选择试验。结果表明:松材线虫和拟松材线虫的部分虫株可以发生种间杂交,正交总交配成功率为4.2%,反交总交配成功率为10%,反交成功率是正交的2倍。杂交整体发生率极低,杂交后代较难形成可持续的繁殖种群。采用松材线虫(简称Bx)/拟松材线虫(简称Bm)快速分子检测系统对杂交F1代幼虫进行分子鉴定,结果表明F1代幼虫既含有Bx分子标记也含有Bm分子标记。继代培养30 d后,杂交后代在基因型上表现出了不同趋向的分化,其中BxAN5♀×Bm JNL1 ♂、BxAN5 ♂×BmAN5♀和BxUSA ♂×Bm JNL1♀的杂交后代趋向于成为松材线虫占主导的种群,BxJNL5 ♂×BmJNL1♀的杂交后代趋向于成为拟松材线虫占主导的种群。在有种内交配资源存在情况下,无论松材线虫还是拟松材线虫均倾向于优先选择种内交配资源。研究表明松材线虫和拟松材线虫之间存在一定的生殖隔离,自然状态下种间交配可能会产生,但杂交后代较难形成可持续性繁殖的生殖后代。     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

3种松材线虫分子检测技术的比较分析

分别用特异性引物法、ITS-PCR-RFLP法和实时荧光PCR法对松材线虫进行了检测,通过检测时间、检测精度和操作情况等方面的比较得出:特异性引物PCR法操作简便、成本低,是目前的常规检测技术;ITS-PCR-PFLP法可以鉴定到小种,相比特异性引物法更具说服力,但耗时较多,适用于线虫种群分化研究和种类鉴定,而不适合作为一种快速检测技术;实时荧光PCR法耗时短,灵敏度高,操作简便安全,只是仪器设备要求较高,适合松材线虫的口岸检验检疫工作.     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，我校森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2h。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DlG—F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。成功设计、合成了TaqMan探针与其配套的引物对F11／R11。     

活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursa phelenchus xylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害，因此，对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义．根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异，通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌一排泄物进行了比较研究，发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌一排泄物存在明显的差别，这种差别可能与松材线虫的致病性有关．     

福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法（贝尔曼漏斗法）研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类：松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。（1）松材线虫;（2）松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;（3）松材线虫和伞滑刃属其它线虫;（4）松材线虫和非伞滑刃属线虫;（5）松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（6）松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（7）拟松材线虫;（8）拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;（9）拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;（10）拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（11）伞滑刃属其它线虫;（12）伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（13）非伞滑刃属线虫;（14）无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法(贝尔曼漏斗法)研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。(1)松材线虫;(2)松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(3)松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(4)松材线虫和非伞滑刃属线虫;(5)松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(6)松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(7)拟松材线虫;(8)拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(9)拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(10)拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(11)伞滑刃属其它线虫;(12)伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(13)非伞滑刃属线虫;(14)无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

松材线虫体内细菌对宿主繁殖和致病力的影响

为探讨松材线虫体内细菌在松材线虫病中的作用,对无菌松材线虫、体内细菌处理的松材线虫和野生型松材线虫的繁殖量和致病力进行了测定。结果表明:在非寄生条件下,无菌松材线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖量显著高于携带细菌的松材线虫; 松材线虫体内寄生菌嗜麦芽窄食单孢菌NSPmBx03胞外代谢产物对松材线虫产卵量具有一定抑制作用。不同处理的松材线虫接种到3年生马尾松后,其繁殖量从高到低为野生型松材线虫>体内细菌处理的松材线虫>无菌松材线虫。对马尾松发病情况观察发现:接种野生型松材线虫的马尾松发病最早,病程最短; 次之为接种体内细菌处理的松材线虫; 最后是接种无菌松材线虫的处理。这表明嗜麦芽窄食单胞菌NSPmBx03对松材线虫在寄生和非寄生条件下繁殖的影响不同,对松材线虫致病力有一定增强作用。     

松材线虫体表物质与其携带细菌的关系

松萎蔫病是由松材线虫与其所携带的细菌复合侵染所引起。为进一步明确松材线虫与其携带细菌的关系,笔者用无菌线虫体表浸泡物处理细菌,再将无菌线虫各虫株与细菌共培养,结果表明细菌的存在可促进线虫的繁殖,线虫体表浸泡物质可促进细菌繁殖,无菌线虫与细菌共培养后线虫繁殖数量较无菌线虫单独培养有明显增加,说明松材线虫与其体表细菌的关系为一种互惠关系。此外还设计了无菌线虫对细菌的趋向性试验,考察线虫与自身体表所携带细菌之间的趋向性是否具有特异性,结果表明所有无菌线虫对成团泛菌具有明显的趋向性,各无菌松材线虫对于分离自各自体表的细菌菌株没有特异的趋向性。     

松材线虫病诊断方法研究进展

松材线虫病[Bursa phelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer) Nickle) Nickle]是松树的一种毁灭性病害,也是重要的森林检疫对象。松材线虫病的诊断方法是防止松材线虫病发生、蔓延及传播的技术保证。笔者就国内外对松材线虫病树木诊断方法的研究进行了综述。     

鞭毛蛋白毒素导致的黑松超微结构病理学变化

【目的】以松材线虫、致病细菌荧光假单胞菌及其鞭毛蛋白毒素、非致病细菌缓慢葡萄球菌等材料对3年生黑松进行接种试验,通过其样枝切片的超微结构病理学变化,了解致病细菌毒素在松萎蔫病中的作用。【方法】分别以野生松材线虫悬液、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+荧光假单胞菌菌株GcM5-1A、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A的鞭毛蛋白毒素Flg、无菌松材线虫+缓慢葡萄球菌菌株AM2C、无菌松材线虫悬液接种黑松,以健康松树为对照。对于发病的处理,在接种后病程的第2或第3阶段取样; 对于未发病的处理,则在接种11 d后取样。取样时,在距离接种点不同位置进行,然后制备透射电镜样品,观察这些切片的超微结构变化。【结果】野生松材线虫、GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+GcM5-1A、GcM5-1A鞭毛蛋白毒素等4种处理下黑松树体组织的超微结构均遭受严重破坏,病理学变化趋势一致。无菌松材线虫、无菌松材线虫+AM2C等两种处理下树体组织基本未遭受破坏,超微结构观察结果与健康松树的基本一致。GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫的处理中,在靠近接种点处,前者处理下切片的超微结构受害比后者严重; 在远离接种点处,前者受害反而比后者轻。通过GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫接种观察结果比较,发现松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,导致毒素的增产和扩散,加速了松树的死亡。【结论】在接种处理的第2阶段是松萎蔫病发展的关键阶段。无菌松材线虫不能致死松树,而松材线虫携带的致病细菌产生的毒素是致死松树的真正原因,验证了松萎蔫病是松材线虫与其携带致病细菌的复合侵染导致病害的假说,而松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,最终导致松树加速死亡。     

基于GIS的中国松树萎蔫病发生的适应性评价

松材线虫在中国被认为是最具有破坏性和威胁性的外来入侵生物种之一.松材线虫潜在的区域扩散不论是从环境保护的角度还是从经济损失的角度都会对森林生态系统健康的服务功能和美学价值产生很大的影响.在中国存在很多的松材线虫容易感染的寄主植物,其中日本黑松和马尾松已经被证明是最容易感染的树种.媒介昆虫松墨天牛(Monochamus alternatus Hope),是松材线虫病在中国传播的主要媒介昆虫.这种天牛主要分布在河北及河北南部的大部分省份,其大范围存在使松材线虫病在中国更大区域的传播和扩散成为可能.中国大部分地区的温度和积温都适合松树萎蔫病病原线虫和媒介昆虫的大面积发生.利用GIS对传媒昆虫、寄主树木、病原线虫以及气候等空间信息处理和分析,得出松材线虫病在中国有着极大扩散和传播可能,其中广东部分地区、广西和福建部分地区为松树萎蔫病理论上发生最为严重的区域;安徽、江苏、浙江、上海、湖南、湖北、贵州、四川、河南和山东部分地区为松树萎蔫病理论上发生的适宜区.科学的预防和严格的地区间检疫等措施对目前防止松材线虫更大范围内传播很有必要.     

灰葡萄孢菌液中活性物质的提取及其对松材线虫的诱引研究

分别以灭菌的淡水细砂和琼脂平板为基质,研究了不同真菌对松材线虫移行的影响,并从灰葡萄孢发酵液中逐级分离提取各种组分,以滤纸片法分析其中对松材线虫移行起作用的物质。结果表明：病木对松材线虫的诱引力较强,经高压灭菌后诱引能力虽有所下降,但下降不大,说明在病木中对松材线虫起诱引作用的物质并没有因高压灭菌而完全丧失,这与 “吸引物质为挥发性物质”的推测相矛盾;但松树皮对松材线虫并没有什么明显的吸引作用,而灰葡萄孢对松材线虫的诱引力一直比较稳定。松材线虫对不同真菌的选择性强弱依次为：灰葡萄孢、盘多毛、酵母、空白（CK）,证明灰葡萄孢是其中对松材线虫最具吸引力的真菌。灰葡萄孢菌液经葡萄糖凝胶LH-20柱层析分离后的生测结果说明,灰葡萄孢菌液的活性物质主要存在于胞外有机相（乙酸乙酯相）中,可能是醇溶性化合物。但随着混合物的逐步分离,对松材线虫的吸引力和稳定性逐渐降低,证明对松材线虫的吸引活性是灰葡萄孢菌液的胞外有机相中几种物质协同作用的结果。     

植物内生菌Bacillus spp.与松材线虫病的关系研究

松材线虫病是重要的森林病害,其致病机理还没有完全研究清楚.从马尾松健康树和松材线虫病树中分离到属于芽孢杆菌Bacillus spp.的植物内生菌,此菌及其代谢产物对断根松苗和离体松枝均有致病作用,且致病症状与松材线虫病类似,但对正常生长的松苗没有作用.这说明这种植物内生菌与松材线虫病有关,是一种弱致病菌.用1 mmol/L的苯甲酸溶液处理接种了松材线虫的松枝,松枝内的线虫照常增殖,但松材线虫病得到抑制.这说明植物内生菌是导致松材线虫病的内因,松材线虫是激发因子之一.     

松材线虫病木中真菌的研究

研究了江苏南京和浙江舟山地区松材线虫病木标本,并进行分离培养,得到10多种真菌,其中Ophiostoma ips,Ophiostoma lignicola,Sphaeropsis salicicola,Dothiorella gregaria和Haplosporella minor出现的最多;在Ophiostomaspp.和Cephalosporium zonatum的培养皿中出现大量的线虫。在天牛的蛹室和虫道中有大量的长喙壳真菌存在,并与线虫的关系密切。实验证明Sphaeropsis salicicola,Dothiorella gre-garia、Haplosporella minor能引起严重的松木变色。     

松褐天牛传递松材线虫数量的研究

松褐天牛从取食开始到试验结束（50d），将松材线虫通过补充营养伤口传递到健康松树，取食到20d时传递的数量最多，每头694条，到第30天数量较多，在此之前和之后数量较少，每头100条左右。松褐天牛将60％的松材线虫传递到当年生树树，随着树枝年龄增加，传递数量减少。实验室和林间试验分离分离测计表明，松褐天牛的身体仍残留一定数量的松材线虫。