2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病的研究进展

非酒精性脂肪肝(NAFLD)在2型糖尿病(T2DM)中具有高患病率的特点。通过饮食及锻炼达到的体重减轻对合并非酒精性脂肪肝的肥胖2型糖尿病患者是有效的。同样,减肥外科手术对此类患者也是有逆转作用的。目前已有研究表明降糖药物胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂及他汀类药物在预防或治疗合并2型糖尿病的非酒精性脂肪肝患者过程中有效。     

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.     

胰高血糖素样肽-1受体激动剂功能性报告基因分析系统的构建

用大鼠胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)基因转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的CH0细胞,成功地构建了基于G蛋白偶联受体信号传导途径的CHO/EGFP/GLP-1R检测细胞系.该细胞系能功能性表达GLP-1R并且能通过cAMP偶联的EGFP报告基因的表达评价GLP-1R激动剂的活性.利用该细胞系本文进一步对5种GLP-1与金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)不同形式连接的融合蛋白进行了体外活性评价.结果表明,5种融合蛋白的活性均低于天然的GLP-1,将GLP-1融合在SPA的N端与C端融合相比,能显著的提高其生物活性.在融合蛋白之问加入不同长度的重复序列(GGGGS),有助于提高其活性,但间隔序列的长短对活性没有显著的影响.以上结果表明,利用CHO/EGFP/GLP-1R细胞系,能够对GLP-1及其类似物的体外活性进行定性和定量的分析,为筛选和开发长效GLP-1类似物奠定了方法学基础.     

胰高血糖素样肽-1改善过氧化氢诱导的血管内皮氧化损伤

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对过氧化氢(H2O2)诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制.方法:取人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为正常对照组、H2O2组、GLP-1组、H2O2+浓度10 nmol/L GLP-1组、H2O2+浓度100 nmol/L GLP-1组、H2O2+浓度1 000 nmol/L GLP-1组.采用荧光显微镜检测细胞内活性氧自由基(ROS)水平、观察细胞骨架F-actin变化;采用流式细胞仪检测细胞凋亡比率;Western Blotting检测磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR)蛋白水平;实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)检测抗氧化酶:过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)基因的表达变化.结果:H2O2组细胞骨架破坏明显,细胞内ROS含量增加,细胞凋亡率增加;加入GLP-1后,细胞骨架破坏受到显著抑制,ROS含量减少,凋亡率降低.Western Blotting结果显示,H2O2组p-m TOR表达降低,GLP-1可以提高p-m TOR表达,使蛋白水平趋于正常;加入GLP-1受体拮抗剂艾塞纳肽(9~36)后,GLP-1不能上调p-m TOR表达.H2O2作用后,CAT、SOD2和GPX1基因表达降低,而GLP-1可以逆转这些基因表达的降低.结论:GLP-1通过上调抗氧化应激酶对抗H2O2诱导的内皮细胞损伤,且可能是通过活化m TOR通路起保护作用.     

MHC单倍体型无特定病原体鸭的培育

目的 培育MHC单倍型无特定病原体单倍型鸭。方法 以国家禽类实验动物种子中心培育并保存的无特定病原体(SPF)麻鸭为基础,根据位于主要组织相容性复合体(MHC)核心区域的鸭抗原处理相关转运体分子(TAP)双拷贝基因(Tap1和Tap2)的多态性,分别利用Tap1基因组短串联重复序列(STR)、TAP2的肽结合区序列以及Tap2全基因组序列的基因型分型,连续选育主要组织相容性复合体(MHC)单倍型SPF鸭。结果 F0代和F1代鸭的STR结果完全一致;F2和F3代鸭的Tap1和Tap2基因组序列完全纯合。连续6个世代的Tap2基因组序列分析,B3群鸭有2个位点发生突变,B1、B2和B4遗传学稳定。结论 成功建立了4个MHC单倍体型SPF鸭群B1、B2、B3和B4,为深入开展鸭的免疫遗传学研究提供了实验动物支撑条件。     

牛肉风味强化肽（BMP）表达载体的构建

牛肉风味强化肽(Beefy Meaty Peptide,BMP)最初是从牛肉木瓜蛋白酶的水解物中分离得到的八肽,它与味精和盐具有较好的协同作用,可以呈现出牛肉风味.为了能够大量、廉价地得到这种风味小肽物质,本文根据毕赤酵母密码子偏爱性设计出4拷贝头尾相连的BMP表达基因,并将其进行体外串联,得到8拷贝、12拷贝和16拷贝的BMP表达基因,将其插入到表达载体pPIC9,从而得到4种不同的毕赤酵母的表达载体.     

无糖基化修饰GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表达、纯化

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠促胰岛素激素,具有很好的综合降糖效果,但其在血浆中的半衰期只有短暂几分钟,限制了GLP-1在临床方面的应用.为延长GLP-1的半衰期,合成了GLP-1-Fc融合基因,将N-糖基化作用的受体天冬酰胺突变为丙氨酸,构建了无糖基化修饰的GLP-1-Fc(N126A)融合表达载体,利用酵母表达系统成功表达了GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白,并利用r Protein A获得了高纯度融合蛋白.     

2型糖尿病患者血清肿瘤标志物CA19-9、CEA与HbA1c、血糖、C肽及脂类的相关分析

目的:评价2型糖尿病患者血清肿瘤标志物CA19-9、CEA质量浓度与糖化血红蛋白(HbA1c)、血糖、C肽、脂类等因素的相关性.方法:随机选取确诊的2型糖尿病患者共202例作为糖尿病组,选取同时期健康体检的健康人202例作为对照组.收集两组CA19-9、CEA及HbA1c、空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPG)、空腹C肽(C_0)、餐后2hC肽(C_2)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TCHOL)、甘油三酯(TG)的检测结果并进行相关性分析.结果:(1)糖尿病组CA19-9、CEA、FBG、HbA1c、TG高于对照组,HDL低于对照组(P0.05).(2)糖尿病组Spearman相关分析结果显示CA19-9、CEA与HbA1c、FBG呈正相关(P0.05);CEA与2hPG呈正相关,与C_0、C_2呈负相关(P0.05).(3)多元逐步回归分析结果显示HbA1c和C_0是影响血清CA19-9水平的因素, HbA1c是影响血清CEA质量浓度的因素.结论:2型糖尿病患者血清CA19-9、CEA质量浓度较正常人高,且与HbA1c、血糖、C肽相关.     

大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因的构建、酵母表达及抗菌活性鉴定

采用Piscidin基因串联表达的方案,通过Eco31Ⅰ限制性内切酶定向连接方法合成Pseudosciaena crocea-Sciaenops ocellatus-piscidin (PSP)串联基因.以毕赤酵母(Pichia pastoris)的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP,转化入毕赤酵母SMD1168菌株中.应用实时荧光定量PCR方法进行多拷贝克隆筛选,实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化,并对其抑菌活性进行初步鉴定,为piscidin抗菌肽的生产应用奠定基础.     

Exendin 4高活性短肽模拟物的筛选及生物活性#br#

以细胞表面胰高血糖素样肽(GLP-1)受体为靶标, 利用噬菌体筛选技术, 通过Exendin-4竞争性洗脱筛选GLP-1受体激动剂, 得到了12肽模拟物EPA. 细胞增殖实验结果表明： EPA和Exendin-4均可促进胰岛β细胞增殖活性, 在40~200 μmol/L内, EPA比Exendin-4的活性高5%~25%; 在100 mmol/L高浓度葡萄糖毒性下, EPA通过抑制bax基因和上调bcl 2基因表达及抑制Caspase 3活性来抑制胰岛β细胞的凋亡; EPA是具有高活性的Exendin-4短肽模拟物, 可通过bcl-2/bax…Caspase 3信号通路抑制线粒体的凋亡.     

Generation of transgenic cucumbers with expression of a ten-tandem repeat long-acting GLP-1 analogue and their biological function on diabetic rats

Glucagon-like peptide-1 （GLP-1） is a 30-amino acid peptide hormone, which has the regulatory function of stimulating the secretion of insulin to balance blood glucose levels. In this study, marker-free expression vector pX6 with a fusion gene of ten tandem repeated GLP-1 analog （[Ser8, Gln26 and Asp34]-GLP-1） genes was constructed and transformed into cucumbers by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method. Four transgenic lines were obtained by PCR and Southern blotting analysis and two transgenic lines successfully expressed the fusion protein （named GLP-T）, which was revealed by Western blotting analysis. The biological activity test results showed that the serum glucose level of diabetic rats was significantly decreased after oral administration of the fusion protein GLP-T extracted from the transgenic cucumber fruitage. These results suggest that this may provide a brand-new strategy to prevent and cure the diabetes with no pain.     

GLP-1R agonists therapy for type 2 diabetes

Glucagon-like peptide-1 receptor （GLP-1R） agonists are widely used for treating type 2 diabetes mellitus （T2DM） be- cause of their glucose-lowering and weight-losing effects, and low risk of hypoglycemia. Hence, there is considerable interest in understanding the mechanism underlying the beneficial effects of GLP-I and developing stable and effective GLP-1R agonists. Here, we summarize the presently known mechanism of GLP-I actions, which are mainly through regulating cAMP-PKA signaling pathway; the latest developments in novel clinical GLP-1R agonists are also introduced, which are characterized with multiple properties, such as extended half-life, reduced side-effects, lower production costs and more convenient drug dosing mode. The potential risk of GLP-I-based therapeutics, an often-ignored fact, is also discussed.     

大肠杆菌菌毛抗原K99基因的亚克隆及核苷酸序列测定

利用PCR技术 ,从含有大肠杆菌菌毛抗原K99基因的质粒pX5K中扩增出 0 .4kb的K99菌毛抗原基因 ,然后将其亚克隆到pGEM T easy载体上 ,并转化至受体菌JM10 9中 ,采用碱性裂解法提取质粒DNA后 ,经NcoI和EcoRⅠ双酶切分析和核苷酸序列分析 ,证明插入的K99基因片段具有正确的核苷酸序列     

重组大肠杆菌高密度发酵表达胰高血糖素样肽-1衍生物(GP62)的培养基优化

对重组E.coli BL21 (DE3)高密度表达胰高血糖素样肽-1衍生物(GP62)的发酵培养基进行了优化.通过单因素实验与正交实验相结合的方法,依次对基础培养基,发酵培养基中碳源、氮源、无机盐等成份进行优化.在2YT培养基基础上,获得优化的发酵培养基2YT-GP62.在5L全自动发酵罐中利用终浓度0.5 mmol/...     

A new long-acting GLP-1 derivative KTP ameliorates hyperglycemia and dyslipidemia and improves pancreas and fatty liver in db/db mice

Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) is a polypeptide incretin hormone that glucose-dependently promotes the secretion and synthesis of insulin. However, its half-life is extremely short. To enhance its half-life, we developed a long-acting GLP-1 derivative KTP with controlled release, designed on the basis of another GLP-1 derivative GP62. The kinetics and bioactivity of KTP were evaluated in Sprague Dawley (SD) rats. Long-term treatment of KTP was performed in db/db mice. Mice were treated twice daily with subcutaneous injections of KTP (1.2 mg/kg body weight), Exendin-4 (0.1 mg/kg body weight) or vehicle (phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4) for 60 d. KTP had a longer half-life, as well as further increasing the secretion and production of insulin and reducing blood glucose concentrations, than GP62. Long-term treatment with KTP also induced anorexia, decreased water and food intake, decreased weight gain, improved blood glucose and blood lipid and ameliorated pancreatic damage and fatty liver in db/db mice.     

补肾清肝疏脾法对 2 型糖尿病 SD 大鼠模型肠道菌群改善及 MAPK 信号通路的影响

摘要:目的 本研究拟评估补肾清肝疏脾法对 2 型糖尿病 SD 大鼠模型的治疗作用及其对 MAPK 信号通路的影响。 方法 选用 2 型糖尿病 SD 大鼠模型,分为模型对照组( 对照组,n = 8) 和补肾清肝疏脾法组( 实验组,n = 8) 。实验组大鼠采用蒸馏水制备的中药方剂,对照组和正常饲养组( 空白组,n = 8) 使用 无 菌 水,连 续 灌 胃 6 个 月,然后采集样品,进行肠道菌群、胰高血糖素样肽-1( GLP -1) 、酪酪 肽 ( PYY) 含 量、体 质 量、空 腹 血 糖 ( FBG) 、血 脂及胰岛素分泌指数的分析。 结果 对照组大鼠 肠 道 内 双 歧 杆 菌 和 乳 酸 杆 菌 显 著 降 低、而 粪 肠 球 菌 及 大 肠 杆菌有明显的增加。 使用补肾清肝疏 脾 法 对 大 鼠 进 行 治 疗 后, Western bolt 结 果 显 示,糖 尿 病 模 型 大 鼠 肠 道 的GLP -1 含量较治疗前有显 著 性 差 异。 ELISA 结 果 显 示,空 白 组 与 对 照 组 大 鼠 相 比, PYY 含 量 未 见 显 著 性 变化;而实验组大鼠其含量增加显 著。 实 验 组 大 鼠 的 血 糖、血 脂、 HOMA-β、体 质 量 与 对 照 组 相 比,在 3 个 月、6个月均有显著性差异。 结论 补肾清肝疏脾法可控制糖尿病的发展,其作用 机 制 可 能 是 通 过 改 善 肠 道 菌 群、GLP -1 和 PYY 含量进行的。     

利拉鲁肽专利技术构成及发展

 利拉鲁肽(Liraglutide)是一种通过基因重组技术并利用酵母生产的GLP-1类似物,主要用于治疗人Ⅱ型糖尿病。围绕利拉鲁肽展开的专利申请自1999年以来连年增多,技术方案的类型也多种多样,主要分为核心专利、DDS专利、联用专利和第二药用专利。核心专利的特点在于先发制人,以原研药专利为中心开展早期布局; DDS专利常用于创造与"新药"的技术交集,利于企业立足自身优势,专注自身发展方向;联用专利以防御为主,在技术交叠区域布局,避免对原研企业的侵权;第二药用专利的特点是在对手已有布局的情况下开发新的技术方向,有利于企业重新占领市场。     

Elf-1基因在急性髓细胞性白血病中的表达情况

目的:建立实时定量PCR检测Elf-1基因表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血Elf-1基因表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测33例AML患者:M2型17例、M3型6例、M5型10例和20例健康人外周血的单核细胞的Elf-1表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用公式2~(-△Ct)×100%计算Elf-1基因表达水平.结果:AML组Elf-1表达水平(13.518±19.197)%明显高于健康对照组(2.044±1.321)%(P<0.01),不同AML亚型之间Elf-1的表达水平没有显著性差异(P=0.52),但各亚型AML的Elf-1的表达水平均与健康对照组比较均有显著性差异(P<0.01).结论:建立SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR分析外周血Elf-1表达水平的方法,检测急性髓细胞性白血病Elf-1基因高表达情况.