皱纹盘鲍基质金属蛋白酶基因的克隆与表达分析

为了探索基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)在软体动物中的存在形式及其在机体抗菌免疫中的作用,以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)为研究对象,采用分子生物学技术克隆得到皱纹盘鲍MMP-16、MMP-17和MMP-21 3个基因部分序列,并对其进行生物信息学分析和多序列比对。此外,利用荧光定量PCR技术检测了Hdh-MMPs在皱纹盘鲍不同组织及副溶血弧菌感染前后各组织中的表达情况。结果显示,克隆得到的Hdh-MMPs序列包含完整的催化结构域和(或)类血红素结合区,Hdh-MMPs蛋白与多种软体动物的MMPs具有序列相似性。荧光定量PCR结果显示,Hdh-MMP-16和Hdh-MMP-17在血淋巴细胞中表达量最高,而Hdh-MMP-21在鳃中表达量最高。副溶血弧菌感染后,Hdh-MMP-16的表达量在鳃中呈现上升趋势,而Hdh-MMP-17的相对表达量呈现先上升后下降的趋势,Hdh-MMP-21基因在鳃和肝胰腺中呈现一定程度的上调表达。本研究结果表明,Hdh-MMP-16/17/21可能与皱纹盘鲍抵御病原菌入侵的先天免疫性调控相关。     

皱纹盘鲍亮氨酸氨肽酶基因cDNA克隆及表达分析

利用PCR和RACE技术从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉中克隆亮氨酸氨肽酶基因cDNA序列,并对其结构进行分析。皱纹盘鲍亮氨酸氨肽酶(Haliotis discus hannai leucine aminopeptidase,Hdh-LAP)cDNA全长共3251 bp,包含5'非编码区(5'UTR)56 bp,3'非编码区(3'UTR)651 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)2544 bp,共编码847个氨基酸残基。多序列比对结果显示,该氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、霸王莲花青螺(Lottia gigantea)、囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的亮氨酸氨肽酶序列相似性分别为85%、68%和61%。预测Hdh-LAP基因编码蛋白质的相对分子质量为95.09 ku,理论等电点为5.16。Hdh-LAP蛋白质的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占38.02%,无规则卷曲占30.11%,β-折叠占22.43%,β-转角占9.45%。Hdh-LAP主要分布在细胞质(59.2%)、线粒体(10.0%)和溶酶体(10%)中,推测其可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。系统发育关系分析结果显示,Hdh-LAP与牡蛎亮氨酸氨肽酶关系最近。荧光定量PCR结果表明,Hdh-LAP基因在鲍肌肉、肝胰腺、性腺、血淋巴细胞、腮、外套膜等6个组织中均有表达,在血淋巴细胞中表达量最高,肌肉次之,性腺最少。     

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。     

豌豆cop1 cDNA的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以拟南芥cop1 cDNA为探针,从豌豆(Pisum sativum) cDNA文库中克隆到了豌豆cop1 cDNA。序列分析表明,它全长为2863bp,其中包括604bp 5′非编码区、243bp 3′非编码区和2016bp编码区,编码672个氨基酸。在大肠杆菌中实现了豌豆cop1基因的高效表达。对拟南芥、豌豆和番茄3种植物cop1的序列同源性比较表明,cop1可能是一种进化上很保守的蛋白质。     

大黄鱼cyclin B1和cdc2 cDNA序列特征及组织表达分析

成熟促进因子(MPF)是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子,在配子成熟过程中具有重要作用.MPF由周期蛋白B(cyclin B,CB)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK1,由cdc2基因编码)2个亚基组成.本研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)cyclin B1(Lc-cb1)和cdc2(Lc-cdc2)基因的cDNA序列,并分析了这2个基因mRNA的组织表达特征,为解析MPF在大黄鱼性腺发育和配子成熟的作用机理奠定基础.Lc-cb1基因全长cDNA 1 882bp,可编码397个氨基酸的蛋白;Lc-cdc2基因全长cDNA序列1 151bp,可编码303个氨基酸的蛋白.基于Lc-cb1 cDNA序列推导的氨基酸序列与6种脊椎动物的CB1氨基酸序列有较高相似性(67%~84%),并具有周期蛋白盒、毁坏盒、以及蛋白酶K位点(RRxSK)等CB预期特征.基于Lc-cdc2的cDNA序列推导的氨基酸序列也与其他6种鱼类的CDK1氨酸酸序列有较高相似性(88%~97%),并具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域、ATP结合相关的保守序列(GxGxxGxV)、周期蛋白结合相关的PSTAIRE序列等CDK1的预期特征.可见,本研究克隆获得的2条序列是Lc-cb1和Lc-cdc2 cDNA全长.实时荧光定量PCR结果显示,Lc-cb1和Lc-cdc2的2个基因mRNA表达具有相似的组织特异性,在性腺中mRNA水平均远远高于其他组织,表明Lc-cb1和Lc-cdc2是大黄鱼性腺发育相关的重要基因.     

微泡菌ALW1几丁质酶Chi18A的克隆及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.)ALW1的基因组为模板,利用几丁质酶基因的特异性引物进行PCR扩增,然后将产物插入到pMD18-T载体后进行DNA序列测定,并对目的基因编码的蛋白质序列进行信息学分析。结果显示,克隆的目的基因大小为1644 bp,预测编码含有547个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的几丁质酶序列具有70%左右的相似性,表明预测目的基因编码几丁质酶。该蛋白质具有2个几丁质结合结构域和1个GH18家族酶的催化结构域,属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)家族18,命名为几丁质酶Chi18A。模拟的三维结构显示,Chi18A含有(βα)_8桶状结构。     

珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

本研究采用RT-PCR方法,首先克隆珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列.结果显示,家鸡PTH3R(cPTH3R)cDNA全长1632bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w)cDNA序列全长1563bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构.此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468bp,编码488个氨基酸,其缺失第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失.利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模.采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析.结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离

以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%～99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

猪Akt3基因克隆、序列分析及组织表达图谱研究

本研究以长白猪(Landrace)肌肉cDNA为模板,克隆得到长白猪Akt3基因.序列分析结果显示:长白猪Akt3基因cDNA全长1493bp,编码一个含479个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为100%、100%、99.58%、99.79%,具有高度保守性.氨基酸结构分析显示,长白猪Akt3基因都具有典型的Pleckstrin homologous domain(PH)结构域和丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活位点.组织表达图谱分析结果显示:Akt3基因在所有检测的家猪组织中均有表达.此外,本研究还将Akt3基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

甘蓝型油菜BnBRI1基因的克隆及表达分析

以拟南芥油菜素内酯受体BRI1基因序列设计同源简并引物,利用同源克隆技术,克隆了甘蓝型油菜中编码油菜素内酯受体基因全长cDNA序列,命名为BnBRI1(GenBank:JX871217),该基因开放阅读框(ORF)大小为3591bp,与拟南芥中BRI1基因(GenBank:NM_120100)相似性为94.21%,编码1196个氨基酸,与拟南芥中BRI编码的氨基酸相似性为89.23%.采用实时定量PCR分析表明,BnBRI1基因在根、茎、叶中都有表达,但表达量存在显著差异.在两叶一心期和花期的根中表达量最高,四叶一心期和抽薹期的叶中表达量最高.     

松墨天牛原肌球蛋白基因的克隆和表达检测

利用先前构建的cDNA文库和RACE方法,克隆了松墨天牛原肌球蛋白基因的cDNA全长,该序列长1 203 bp,命名为MaTm(GenBank登录号:KM099072),其中开放阅读框长852 bp,编码283个氨基酸.MaTm的氨基酸序列与赤拟谷盗 (Tribolium castaneum)相似性最高,为97%,与家蚕相似性 (Bombyx mori)为94%.松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上.用 RT-qPCR 分析了MaTm的相对表达量,结果显示:蛹和幼虫的表达量低于成虫;成虫足和头的表达量高于对照;在幼虫各组织中均有表达,且差异显著(p0.05),其中在体壁的表达量最高.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

野桑蚕Ras 2基因的cDNA分子克隆及其特征

基于家蚕(Bombyx mori)Ras2基因的cDNA序列设计引物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)Ras2基因,得到的cDNA序列长631bp,含有一个603bp的完整开放阅读框,由2个外显子和1个内含子组成,编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质的等电点为6.33,分子量为22.866kD.其氨基酸序列与其他昆虫Ras2氨基酸序列的同源性较高,且具有它们Ras2基因的典型特征.组织表达谱表明,该基因mRNA在野桑蚕的表皮、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺中均有不同程度的表达.     

大熊猫核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的cDNA克隆及序列分析

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料,成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫L30亚基基因的表达序列长为388bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,并含有6个功能位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性,其表达序列同源性分别为93.97%,96.26%,89.66%和89.94%,其编码的氨基酸序列同源性分别为99.13%,98.26%,99.13%,99.13%,且其蛋白质的高级结构相似性也很高.     

结球甘蓝γ-生育酚甲基转移酶cDNA的克隆、分析及其异源表达酶蛋白的功能研究

采用3′-和5′-RACE技术,从结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)幼苗顶芽中克隆了γ-生育酚甲基转移酶的全长cDNA序列(BoTMT).该cDNA长1265bp,包含一个1044bp的开放阅读框,编码包括叶绿体导肽和两个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)在内的347个氨基酸组成的蛋白质.序列分析表明该蛋白质与目前已知的γ-生育酚甲基转移酶有41.8%～86.5%的同源性.半定量RT-PCR结果显示BoTMT主要在结球甘蓝的花和叶器官中表达.将BoTMT的成熟蛋白编码区序列克隆至原核表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的22%.体外酶活性测定结果表明表达的蛋白质具有γ-生育酚甲基转移酶活性,能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚.     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1~15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%~65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

人Oligophrenin 1样(OPHN1L)基因的克隆

将人Oligophrenin 1(OPHN1)基因编码区2406 bp与EST数据库进行同源性分析,得到一个363 bp的EST AA035622与OPHN1基因编码区一致性为62%,该EST与一个cDNA序列AB014521完全匹配.在ABO14521中设计引物与cDNA文库载体臂上引物行巢式PCR扩增并进行5′RACE,在胎盘cDNA文库中获得cDNA序列606bp,与AB014521拼接成一个6906 bp的cDNA序列,其中包含一个2442 bp的开放阅读框,编码813个氨基酸.该cDNA序列的GenBank登录号为AF141884,并经GDB命名委员会命名为OPHN1L基因.OPHN1L基因3′端与大规模测序的BAC克隆AC005348及AC004782完全匹配,从而将该基因定位于5q21.2～q21.3,并由此获得它的部分基因组结构.     

毛竹硅转运基因PhLsi1的ORF克隆及生物信息学分析

以水稻硅的内转运蛋白基因Lsi1的cDNA序列为信息探针,对毛竹的核酸数据库进行同源性搜索,获得全长为797bp的毛竹硅内转运蛋白基因的cDNA序列(Genbank登陆号:FP095571).与水稻Lsi1的cDNA序列相比,毛竹中该基因cDNA序列第721位处发生终止突变,导致毛竹Lsi1丢失了86个氨基酸残基.采用RTPCR方法对其进行克隆,序列分析表明,PhLsi1基因在编码时确实存在提前终止现象,共编码212个氨基酸,与水稻、玉米和大麦中已克隆的硅内转运蛋白(silicon influx transporter,含有6个跨膜螺旋区和2个NIP保守基序)的序列相似性分别高达99.3%,91.9%,91.9%,但只具有5个跨膜螺旋区和1个NIP保守基序.     

杂色鲍肌动蛋白启动子的克隆与序列分析

杂色鲍(H.diversicolor diuersicolor)是我国华南地区重要的海水养殖对象,作为利用转基因技术改良杂色鲍品质研究工作的首要部分,作者利用PCR和染色体步移(Genome Walking)方法克隆了杂色鲍肌动蛋白基因编码区部分序列和启动子序列(GenBank登陆号:EU622901).所分离的肌动蛋白基因DNA序列片段全长为1 990 bp,与GenBank中彩虹鲍(Haliotis iris)肌动蛋白A1基因序列和肌动蛋白A1a基因序列有非常高的相似性(99%和96%).在基因编码区中间发现了一个内含子区,在编码区之前发现一个类启动子区,经过Promoter Prediction在线软件分析,发现了该启动子序列和转录起始位点,同时也发现了该启动子特有的启动元件两个标准的CAAT BOX和一个TATA BOX.这些实验结果表明所克隆的杂色鲍肌动蛋白和启动子序列符合实验的目的.并且这一实验的成功也为下一步利用所分离的启动子做杂色鲍转基因工作打下基础.