(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.     

人胰岛素原类似物（B-Arg-Arg-A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（PCR）法将C肽为6个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成C肽仅为2个精氨酸残基的胰岛素原类似物（BArg-Arg-A）基因,即把pUC18BC'A改建为pUC18BR₂A。再将pUC18BR₂A与pJG105重组为表达质粒pJG107,使B-Arg-Arg-A与pJG105编码的一种多肽构成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的58%。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

人胰岛素原类似物（B—Arg—Arg—A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）法将Ｃ肽为６个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成Ｃ肽仅为２个精氨酸残基的胰岛类原类似物基因，即把ＰＵＣ１８ＢＣ＇Ａ改建为ＰＵＣ１８ＢＲ２Ａ。再将ＰＵＣ１８ＢＲ２Ａ与ＰＪＧ１０５且为表达质粒ＰＪＧ１０７，使Ｂ－Ａ－Ａ与ＰＪＧ１０５编码的一种多肽成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的５８％。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

泛素特异性蛋白酶2a的表达及催化机制

研究USP2a在肿瘤发生发展中的催化机制,设计引物对USP2a的关键氨基酸残基Asn218,Cys223,His464和Asn482进行点突变,分析突变后对USP2a催化活性以及底物特异性的影响。利用荧光检测方法测定USP2a-WT和USP2a-Ms的酶促动力常数,并采用LC-MS/MS与SDS-PAGE方法分析USP2a-WT和USP2a-Ms的异肽酶活性,获得了可溶性表达的USP2a-WT和USP2a-Ms重组蛋白。结果表明,氨基酸残基Cys223和His464突变后酶失去活性,其余突变体分解底物Ub-AMC的催化效率与野生型无显著差异,氨基酸残基Asn218和Asn482单独突变后对酶活性没有显著影响,但双突变体USP2a-N218A/D482A则显著降低酶活性。USP2a的氨基酸残基Cys223和His464直接参与酶的催化反应;氨基酸残基Asn218和Asn482可能通过形成Asn218-Asn482电子对在催化过程中起到稳定氨基酸残基His464的作用。     

抗栓胰岛素原钙调素重组融合蛋白表达条件的摸索

以无活性人胰岛素原突变体为分子支架,在C肽位置嵌合特异拮抗血小板GPⅡbⅢa受体的去整合素活性结构位点序列,构建嵌合人胰岛素原突变体.该突变体相对分子质量大小为7.0×103,与钙调素的C末端融合后形成新型重组融合蛋白质,相对分子质量为24.7×103.构建该重组融合蛋白质的大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,尝试在大肠杆菌表达体系中,对该重组融合蛋白质进行高效表达.结果表明,该重组融合蛋白质的表达率约占菌体全蛋白的30%,优化后的表达条件为25℃,50μmol.L-1诱导表达16 h.     

钙调素-人胰岛素原融合体的酶切加工

通过基因工程方法将人胰岛素原突变体偶联钙调素形成融合态重组蛋白质,在该重组蛋白质中设计具有PRESCI蛋白酶酶切位点.制备PRESCI蛋白酶并对钙调素-人胰岛素原突变体重组蛋白质进行酶切加工.研究表明,该重组融合蛋白质可被有效切割,通过蛋白质纯化手段能够有效地将切割后的钙调素与人胰岛素原突变体进行纯化.     

中介蝮蛇毒L-氨基酸氧化酶基因的生物信息学分析

采用生物信息学方法,对中介蝮蛇毒L-氨基酸氧化酶(GI-LAO)基因进行了分析。结果表明:GI-LAO基因所包含的开放阅读框为1 515bp,编码504个氨基酸残基;GI-LAO一级结构与白眉蝮GH-LAO的相似性最高,达99%;N-端的18个氨基酸残基为信号肽,成熟肽含486个氨基酸残基,相对分子质量为55.1kDa,理论等电点为6.55;该蛋白含有两个结构域:FAD结合域(56-123位氨基酸残基)和催化结构域(61~499位氨基酸残基);与白眉蝮GH-LAO序列比对发现,有4个氨基酸位点存在差异(分别是20、56、99和467位氨基酸残基),用SIFT软件分析表明,这四个位点对其功能无影响;该基因编码的氨基酸序列有2个活性位点(H242和R343),2个N-糖基化位点(N190和N379),5个位点(R108、H241、Y390、G482和W483)与底物结合有关,4个保守半胱氨酸残基形成两对二硫键(C28—C191和C349—C430);三维结构建模结果表明,GI-LAO形成同源二聚体,每个单体由22个α-螺旋,22个β-折叠股和一些无规则卷曲、转角等形成三个结构域:FAD结合域,底物结合域以及α-螺旋域;在GI-LAO蛋白的进化分析中,中介蝮GI-LAO与白眉蝮GHLAO的亲缘关系最近。     

虫荧光素酶N末端缺失

目的是通过虫荧光素酶Ｎ末端氨基酸的缺失,研究缺失对酶活性的影响。采用聚合酶链式反应的方法,构建虫荧光素酶Ｎ－末端缺失７,８,９个氨基酸残基的突变体,导入大肠杆菌ＤＨ５α菌株中直接得到表达,再分离纯化粗酶,并检测酶活。结果表明,Ｎ末端缺失７个氨基酸的突变体几乎没有活性（小于天然活性的０．５％）,Ｎ末端缺失８个以上氨基酸残基的突变体则完全丧失活性。由于Ｎ末端缺失６个氨基酸的突变体保持了７７％的酶活性,因而萤火虫荧光素酶Ｎ末端第７个氨基酸与酶的催化活性密切相关。     

用点突变方法研究海参精氨酸激酶的活性位点

为研究动物能量代谢,用点突变的方法从双亚基海参(Stichopusjaponicus)精氨酸激酶中得到了3个突变体:C274A、R283G和H287A,并通过大肠杆菌E.coli表达。大部分精氨酸激酶都以包涵体的形式存在。经过纯化之后对3种突变体的催化活性和一些结构特征进行了分析。这3种突变体丧失了绝大部分催化活力,特别是突变体C274A,与野生型相比除了活性完全丧失之外,结构却几乎没有变化。这3个残基对海参精氨酸激酶结构或功能的保持有着重要作用,Cys274残基可能是海参精氨酸激酶的活性位点。     

中国白兔IL-6基因的分子克隆及其表达研究

运用RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果中国白兔IL-6基因全长726 bp,编码242个氨基酸,其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IL-6基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IL-6氨基酸序列中,在108-110位存在1个潜在的N-联糖基化位点,同时存在9个Cys残基.将pTIL-6双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-6,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为29.5kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的16.2%.     

鸡溶菌酶和重组大肠杆菌融合蛋白(NADP-GDH)体外分子交联的初步研究

用PCR方法克隆的大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶 (NADP specificglutamatedehydrogenase ,NADP GDH)基因和其突变基因 ,插入表达载体pTrcHisC构建重组蛋白质表达体系 .经过IPTG诱导表达 ,用Talon固定化金属亲和层析树脂纯化出重组的天然和突变NADP GDH ,将它们和溶菌酶 (Lysozyme)通过热诱导去折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验 ,在去折叠反应液中加入还原剂二硫苏糖醇 (DTT)后 ,不但没有分子间二硫键交联形成 ,同时也没有其他分子间共价键 (异肽键 )交联的形成 .另外 ,半胱氨酸残基定点突变后的NADP GDH重组蛋白质 ,无法参与形成分子间二硫键 ,实验证实经过热诱导去折叠后也没有分子间共价键 (异肽键 )交联 .这些结果进一步证明蛋白质分子间二硫键的形成能够促进蛋白质其他分子间共价键 (异肽键 )的形成 .     

抗冻蛋白基因定向突变及其抗冻关系的研究

为探讨抗冻蛋白的抗冻机制,根据抗冻活力较高的肝型抗冻蛋白的氨基酸组成,改造皮肤型抗冻蛋白基因,使皮肤型抗冻蛋白基因的10位氨基酸－丙氨酸（A）改造成天冬氨酸（D）,方法：合成一段含有突变位点的DNA片段,用其取代野生型DNA上相对应的片段,DNA测序法筛选阳性克隆并表达该蛋白,Western-blot法、氨基酸组成分析法、及质谱法鉴定表达蛋白,测定突变后抗冻蛋白的的活力并与野生型比较,以期揭示抗冻蛋白的抗冻机制。     

Counting integral numbers of amino acid residues per polypeptide chain

Proteins have integral numbers of each of the 20 amino acids. However, all the currently accepted methods of determining this number measure the ratio of moles of amino acid residue per mole of protein. This value is rarely close to an integer, due to experimental errors in determination of the molar amounts of both amino acid residues and polypeptide chain. A simple method which gives integral values of amino acid residues per polypeptide chain, independent of any other properties of the protein, would be useful in characterising proteins. We describe here one method; it is illustrated for the case of Cys residues, although the approach should be useful for many of the other 19 usual amino acids.     

6个氨基酸小C肽人胰岛素原类似物基因的构建和表达

用片段置换法，从在Ｃ肽两端具有酶切位点的双突人胰岛素原因中，将Ｃ肽基因替换成含Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ６个氨基酸小Ｃ肽基因。将这个小Ｃ肽岛素原类似物基因重组到具有Ｔａｃ启动子的质粒中，并与部分牛凝乳酶原基因融合，在Ｅ．ｃｏｌｉ中得到了高效表达。表达的ＢＣ＇Ａ融合蛋白占菌体总蛋白的１６％。表达产物以包含体形式存在，经ＣＮＢｒ裂解及磺酸，再经复性后，具有对胰岛素的放射免疫活性。     

耐热、高产重组人Cu,Zn-SOD改构体的构建及纯化方法的研究

目的通过对天然人Cu,Zn-SOD基因的改造,得到热稳定性、活性产量提高的重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)改构体,并进行蛋白纯化方法的研究。方法重叠PCR技术将天然hCu,Zn-SOD的Cys6突变为A la6,Cys111突变为Ser111,构建重组质粒pET22b-rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE分析改构体蛋白的表达,并进行W estern blot鉴定;研究改构体蛋白的纯化方法,HPLC检测蛋白纯度,比较rhCu,Zn-SOD及其改构体的活性和热稳定性。结果成功构建了rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser表达载体;SDS-PAGE显示rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser蛋白在BL21(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量占菌体蛋白总量的64.6%;Western blot结果显示表达产物可以特异性地与小鼠抗人SOD多克隆抗体结合;纯化得到纯度大于95%的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Se改构体蛋白,从1g湿菌体中获得的活性蛋白总量高于未改构体的2倍;改构体的热稳定性较未改构体获得大幅提高。结论构建的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser改构体具有较好的热稳定性和较高的活性产量,摸索出一种比较简易的蛋白纯化工艺,为Cu,Zn-SOD的广泛应用奠定基础。     

内生枯草芽孢杆菌HD-1β-甘露聚糖酶基因的克隆及结构生物学分析

采用PCR技术从一株内生枯草芽孢杆菌HD-1基因组DNA中扩增出β-甘露聚糖酶基因核苷酸编码序列.序列分析表明,该基因全长1 089bp,编码362个氨基酸和一个终止密码子,N端前27个氨基酸为其信号肽.该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露糖苷酶同源性最高达98.34%,具有ManB保守结构域,属于糖苷水解酶家族26的一员.通过对该酶分子三维结构的预测分析,该酶的催化域形成TIM桶状结构,Cys92和Cys112形成二硫键,它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心,Glu100和Glu292分别为该酶的酸碱催化位点和亲核催化位点.三维结构的分析为提高酶的催化活性的和功能方面的定向改造提供了依据.     

Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris

The gene of human thyrnosin alpha 1 (hT(1)was synthesised according to favorite eodons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24Ethat is N-aeetylserine were replaced by hT( 1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thyrnosin α1. And also, the Asn-Gly bond was designed to faeiliate isolation of the target protein. The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/gK. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by eleetroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully.     

Is sequence conservation in interferons due to selection for functional proteins?

The human alpha-interferon (IFN-alpha) gene family consists of at least 14 potentially functional non-allelic members; the amino acid sequences they encode differ from each other by up to approximately 20% of their residues. Human IFN-beta, which is encoded by a single gene, is distantly related to the IFN-alpha family; it differs in 67% of its residues from IFN-alpha 2. There is considerable evidence that IFN-alpha and -beta compete for the same receptors on their target cells. Comparison of 14 non-allelic human IFN-alpha sequences and the IFN-beta sequence has revealed that 37 of 166 residues are completely conserved and that several of these are arranged in clusters, for example at positions 29-33, 47-50 and 136-150. It is commonly held that evolutionary conservation of amino acids indicates that the residues in question are essential for function. To test this hypothesis in the case of IFNs, we have introduced single site-directed point mutations into the strictly conserved codons 48 and 49 of the IFN-alpha 2 gene which form part of the longest uninterrupted cluster (position 47-50). We report here that the mutant proteins, containing Tyr, Ser and Cys instead of Phe48, or His instead of Gln49, have biological activities indistinguishable from those of wild-type IFN-alpha. In addition, when Glu62, a residue conserved in all known alpha and beta IFNs of man, mouse and cattle, was replaced by Lys, antiviral activity remained unchanged.     

中华补血草金属硫蛋白基因的克隆及高盐处理下的表达模式分析

以中华补血草叶片为材料,提取其总RNA并反转录cDNA,并以cDNA为模板,克隆得到包含该基因完整开放阅读框的cDNA序列,序列分析表明,该基因开放阅读框长249 bp,编码82个氨基酸;该蛋白含有14个半胱氨酸,主要分布在蛋白质的N端和C端,呈CC,CX,CXXC形式排列.预测该蛋白分子质量为8 133.1 D;等电...