DNA免疫制备抗人CD154单克隆抗体及其轻链可变区基因序列分析

采用pcDNA3 1 hCD15 4重组质粒DNA免疫BALB c小鼠 ,制备抗人CD15 4单克隆抗体 ,得到了能分泌针对人T细胞表面CD15 4分子的特异性单抗的杂交瘤细胞株 (7E8)。通过RT_PCR扩增 7E8单抗轻链可变区基因 ,并对其进行克隆、测序、DNA序列分析和氨基酸推导 ,结果显示轻链可变区基因和氨基酸序列完全符合小鼠Ig轻链的结构特征 ,为制备基因工程抗体并应用于临床打下了基础。     

杂交瘤细胞株功能性与非功能性V_k基因结构分析

本研究利用逆转录PCR技术和家族特异性引物,先后从9株分泌不同特异性单抗杂交瘤细胞株中扩增出了轻、重链可变区基因,并经克隆和序列测定。其中利用轻链引物(VL5.1和VL3.1)从分泌抗转铁蛋白受体(anti-transferrlin receptor)单抗的杂交瘤细胞株(7579)中扩增出了无功能的V_k序列。经分析和与GenBank数据库比较,该序列虽与BALB/cV_k21-E细胞株分泌的抗体轻链有98％同源性,但是在其V/J连接区内有4个碱基对缺失,导致后续阅读框架移位,因而出现终止密码子而致翻译停止。当改变引物(VL5.2和VL3(JK1/2))之后,又分别从该种杂交瘤细胞株中扩增出有功能的V_k基因序列。说明同种杂交瘤细胞中,部分细胞出现基因异常性重排(aberrant rearrangement),而这种重排的V-J基因片段来源于原融合细胞MOPC-21骨髓瘤细胞系。     

抗人红细胞单链抗体基因的构建及表达

从分泌抗人红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞３Ｆ５中提取总ＲＮＡ,逆转录成ｃＤＮＡ,用合成的寡核苷酸引物通过ＰＣＲ扩增和克隆单抗的轻、重链可变区基因,用双脱氧核苷酸链终止法分析核苷酸序列,采用ＰＣＲ拼接法构建单链抗体基因,并插入原核表达载体ＰＥｔ－２８ａ,转化大砀杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,经ＩＰＴＧ诱导后表达,序 分析表明所克隆的ＶＬ、ＶＨ分别属于鼠ＩｇＫａｐｐａ轻链ＩＶ亚组和Ｉｇ重链Ⅱ亚组,ＶＨ、ＶＬ基     

抗牙周病厌氧菌单链抗体基因的构建与表达

从牙周病厌氧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株出发，通过基因工程方法－ＰＣＲ技术，调出其抗体的重链和轻链基因可变区序列，体外重组后得到单链抗体片段，克隆到了ｐＣＡＮＴＡＢ５载体上，在ＴＧ１中得到了成功表达。     

抗牙周病厌氧菌（Bg）单链抗体基因的构建与表达

从牙周病厌氧菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）单克隆抗体的杂交瘤细胞株出发，通过基因工程方法──ＰＣＲ技术，调出其抗体的重链和轻链基因可变区序列，体外重组后得到单链抗体ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｖａｒｉａｂｌｅ）片段，克隆到了ｐＣＡＮＴＡＢ５载体上，在ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＴＧｌ中得到了成功表达。     

鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

研究以AFB1-BSA免疫的小鼠脾脏细胞为试验材料,利用RT-PCR技术,克隆了抗AFB1抗体重链和轻链可变区基因VH和VL,利用连接肽(Gly4Ser)3将VH和VL链接成单链抗体基因scFv,通过噬菌体展示载体pCANTAB-5E携带将其电转化E.coli TG1,经氨苄青霉素平板筛选,构建了库容为2.13×109 cfu/μg DNA的噬菌体单链抗体库,抗体库的克隆阳性率达到100%,且多样性良好,为高活性抗AFB1单链抗体的筛选提供了材料基础。     

暗纹东方纯CD8α基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

CD8是与Ⅰ型主要组织相容性复合体（MHCI）结合，是T细胞表面受体（TCR）的共受体．也是T淋巴细胞表面的重要标志物。该研究报道了暗纹东方纯胸腺等组织中克隆获得CD8αcDNA序列及其相应的基因组序列。克隆到的cDNA序列全长1061bp，包含1个657bp的开放读码框（ORF），编码218个氨基酸；其对应的基因组序列为1533bp，包含5个内含子和6个外显子。生物信息学分析表明，D8d蛋白质序列由信号肽、胞外可变区、铰链区、跨膜区和胞内区5部分组成。胞外区的可变区和铰链区部分各有两个高度保守的半胱氨酸残基，可能参与链内和链间二硫键的形成。氨基酸序列多重比对表明，暗纹东方鲍与其他鱼类的CD80α，特别是与鲽形目鱼类具有较高的同源性。为进一步研究暗纹东方纯CD8的生物学功能，构建了表达CD8α成熟肽胞外区的重组质粒，诱导表达出重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫大白兔，制备了抗血清。经间接ELISA法检测抗体效价表明。获得了高效价的特异性暗纹东方纯CD8c~抗体，为进一步研究CD8在鱼类淋巴细胞进化和适应性免疫中的作用奠定了基础。     

噬菌体显示抗乳腺癌单链抗体的基因克隆和筛选

克隆和连接乳腺癌杂交瘤单克隆抗体的轻、重链可变区基因，构建该单链抗体的噬菌体显示系统，经严格的相关肿瘤细胞株的固相细胞正负筛选和多步液相结合-洗脱细胞筛选，得到特异性高、亲和力强的单链抗体基因，用于进一步构建重组免疫毒素，为临床乳腺癌和生物靶向治疗奠定基础.     

鳜免疫球蛋白轻链基因在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR技术从鳜(Siniperca chuatsi)头肾总RNA中获得了免疫球蛋白轻链cDNA,克隆到pGEM-T载体上并测序.测序的2个克隆其可变区cDNA序列相同率为97.3%,属于鳜的同一个轻链可变区基因家族,其变异主要存在于互补性决定区.根据鳜与其他辐鳍鱼类轻链氨基酸序列的多重对准,鳜同鲑(Salmo salar)的可变区的相似性最高(65.7%).而在恒定区,鳜同花狼(Anarhichas minor)的相似性最高(96.3%),都存在特有的连续的丝氨酸残基;鳜同虹鳟(On-corhynchus mykiss)L1型(62.1%)和斑点叉尾(Ictalurus punctatus)G型(57.2%)轻链也有较高的相似性.将鳜轻链基因分别克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pExSec1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式得到高效表达.另外,结合鳜轻链基因序列及其表达产物的分析结果,推断鳜也有两类轻链.     

人转铁蛋白基因的克隆及序列分析

目的:克隆人转铁蛋白基因并对其编码序列进行分析.方法:以人胎肝cDNA为模板,利用PCR方法克隆人转铁蛋白基因;通过与基因组序列对比分析基因组结构;通过TargetP 1.1和SignalP 3.0预测信号肽;通过Clustal X(1.81)进行蛋白序列联配.结果:PCR扩增了一个长2 160 bp的基因片断,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由698个氨基酸组成的人转铁蛋白.进一步分析发现人转铁蛋白基因有19个外显子和18个内含子,编码人转铁蛋白N端具有19个氨基酸组成的信号肽序列.人转铁蛋白与猩猩、猴子、兔子和老鼠的转铁蛋白氨基酸相似率分别为94%、91%、78%、73%.生物信息分析表明,人转铁蛋白含有高度保守的参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点,有两个序列较同源的结构域.结论:成功克隆人转铁蛋白基因,人转铁蛋白与其它物种转铁蛋白同源.