猕猴不同组织器官中黄嘌呤脱氢酶 /氧化酶基因的mＲNA 表达的半定量 ＲT - PCＲ 检测方法的建立

摘要: 目的 建立半定量 ＲT-PCＲ 检测方法检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶( XDH /XO) 的 mＲNA 的表达。方法 分别提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总 ＲNA,用 ＲT-PCＲ 二步法进行 XDH /XO 基因片段扩增,内参基因选用管家基因 GAPDH,对获得的目的片段进行序列测定以鉴定其特异性,在凝胶影像分析仪 Quantity one 软件得出其电泳条带的灰度值( IOD) ,计算目的基因与内参基因比值得到猕猴不同组织 XDH/XO 的 mＲNA 的相对表达量。结果 建立了半定量 ＲT-PCＲ 检测方法,猕猴不同组织 XDH /XO 的 mＲNA 表达在肝脏组织中表达水平最高,其次为心肌,肾脏,睾丸,皮肤。结论 本研究所建立的半定量 ＲT-PCＲ 检测方法可应用于检测猕猴各组织器官组中的 XDH /XO 的mＲNA 的表达差异。     

猕猴不同组织器官中黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的mRNA表达的半定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立半定量RT-PCR检测方法检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶(XDH/XO)的mRNA的表达。方法分别提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总RNA,用RT-PCR二步法进行XDH/XO基因片段扩增,内参基因选用管家基因GAPDH,对获得的目的片段进行序列测定以鉴定其特异性,在凝胶影像分析仪Quantity one软件得出其电泳条带的灰度值(IOD),计算目的基因与内参基因比值得到猕猴不同组织XDH/XO的mRNA的相对表达量。结果建立了半定量RT-PCR检测方法,猕猴不同组织XDH/XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平最高,其次为心肌,肾脏,睾丸,皮肤。结论本研究所建立的半定量RT-PCR检测方法可应用于检测猕猴各组织器官组中的XDH/XO的mRNA的表达差异。     

高尿酸血症大鼠模型血清代谢组学研究

 通过检测高尿酸血症大鼠血清代谢谱的变化, 探讨代谢组学在高尿酸血症研究中的应用。将20 只清洁级健康SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为高尿酸血症模型组(10 只)和空白对照组(10 只), 每日采用酵母膏(YEP)21 g·kg^-1·d^-1给予喂养, 氧氢酸钾(OA)以200 mg-1·kg^-1·d^-1腹腔注射1 次, 建立高尿酸血症大鼠模型。第28 日收集空白对照组和模型组大鼠血清, 进行¹H-NMR 谱测定和主成分分析。与空白对照组大鼠相比, 模型组大鼠血清中糖蛋白、丙酮酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸显著增加, 而甲酸浓度及极低密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、丙酮显著降低。由此得出, 高尿酸血症大鼠血清代谢组学发生明显变化, 血浆代谢组学在一定程度上反映高尿酸血症大鼠的病理生理变化。     

高尿酸血症及尿酸性肾病动物模型的建立及应用

为建立高尿酸血症及尿酸性肾病动物模型 ,以不同剂量腺嘌呤分别饲喂大鼠 ,并设别嘌呤醇作为治疗组 ,监测血尿酸、尿尿酸及肾功能变化 ,并进行肾组织病理形态学及超微结构观察。结果示中剂量组大鼠于实验第三天血尿酸水平升高 ,可持续一周。第十天出现肾功能损害 ,并可见间质性肾炎改变。别嘌呤醇组改变不明显。中剂量组大鼠可作为观察药物预防作用的高尿酸血症及尿酸性肾病动物模型     

人源IFITM2基因检测方法的建立及EMCV感染对IFITM2基因转录的影响

目的:建立一种干扰素诱导跨膜蛋白2(IFITM2)基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,以期为IFITM2基因的动态监测提供有效的检测技术.方法:根据GenBank中公布的IFITM2基因序列设计特异性引物,以质粒pMD18-T-IFITM2为模板进行条件优化,绘制标准曲线,建立IFITM2基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行条件优化与评价,用建立的方法对脑心肌炎病毒感染后细胞中IFITM2基因转录水平进行检测.结果:建立的20μL检测体系中IFITM2基因最佳引物浓度为10μM,最佳退火温度为59℃;标准质粒在2.62×10~5～2.62×10~(10)copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好线性关系,线性方程y=-3.495 logx+43.12,R~2=0.998,且灵敏性、特异性和重复性均较高.应用建立的方法对EMCV感染细胞中IFITM2基因转录水平进行检测,结果显示,在感染早期IFITM2转录水平不变,感染后期转录水平逐渐升高.EMCV感染引起宿主IFITM2基因转录水平的变化,可能与EMCV逃逸宿主相关免疫应答有关.结论:成功建立了一种快速、准确检测IFITM2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.该方法的建立,为进一步研究IFITM2在EMCV感染过程中的作用奠定了基础.     

瑞舒伐他汀钙干预对高尿酸血症所致大鼠内皮功能紊乱的影响

 为探讨瑞舒伐他汀钙(rosuvastatin)对高尿酸血症大鼠模型及其内皮功能紊乱的影响,将72只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠随机分组,采用酵母膏和氧嗪酸钾腹腔注射方法,建立高尿酸血症动物模型.设别嘌呤醇干预为阳性对照,以2.5、5.0和10.0mg瑞舒伐他汀钙/kg剂量干预动物模型,采用专用试剂盒测定尿酸(UA)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、血管紧张素II(AngII)的血清水平,免疫组织化学鉴定主动脉组织的一氧化氮合酶(eNOS)蛋白质表达水平变化.结果显示,与对照组比较,高尿酸血症动物模型组血清UA、ET-1和AngII显著升高,血清NO降低,主动脉内皮组织eNOS表达水平降低.瑞舒伐他汀钙干预动物模型后发现,随着药物剂量和干预时间的增加,该药改善以上内皮功能紊乱相关的指标,使之逐渐恢复至正常水平,当瑞舒伐他汀钙干预剂量为10mg/(kg·d)和干预6周时,与非药物干预的模型组有显著差异,其改善内皮功能效果明显高于嘌呤组(阳性对照组).由此表明,瑞舒伐他汀钙通过升高血清中NO和eNOS的蛋白表达,降低血浆ET-1及AngII,从而改善高尿酸血症大鼠的血管内皮功能,并且该作用呈剂量依赖性.     

肥胖SD大鼠骨骼肌组织中SOCS-3mRNA的表达

目的：初步探讨肥胖sD大鼠骨骼肌组织SOCS-3mRNA的含量与高leptin血症的关系。方法：用高脂饮食制备饮食诱导的肥胖（DIO）SD大鼠模型，应用放射免疫分析法检测血清leptin水平，应用RT-PCR半定量检测骨骼肌组织中SOGS-3mRNA的含量，并进行相关分析。结果：DIO大鼠存在高leptin血症，但其骨骼肌组织中SOCS-3mRNA的含量与对照大鼠没有差别，而且骨骼肌组织中SOCS-3mRNA的含量与大鼠的肥胖程度及血清leptin水平没有相关性。结论：DIO大鼠的leptin抵抗与骨骼肌组织中SOCS-3mRNA的含量无关。     

齐墩果酸对衰老大鼠睾丸间质细胞胰岛素/IGF1通路关键基因表达的影响

为了探讨齐墩果酸对衰老大鼠睾丸间质细胞的作用,采用MTT法确定齐墩果酸最适药物浓度,氧化应激创建大鼠睾丸间质细胞衰老模型,RT-qPCR、免疫荧光和免疫印迹检测胰岛素/胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)信号通路关键基因转录情况和蛋白翻译情况,采用INSR抑制剂处理细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果显示:与正常组相比,INSR、IRS1、IRS2、IGF1的mRNA转录水平和蛋白翻译水平显著下降(P<0.05);IGFBP3的mRNA转录水平显著提高(P<0.05),免疫荧光和免疫印迹均未检测到此基因表达;与衰老组相比,齐墩果酸组明显逆转此现象(P<0.05);齐墩果酸能明显抑制衰老组细胞的凋亡(P<0.05),INSR抑制剂处理后,细胞凋亡率明显高于齐墩果酸组(P<0.05).综上可知,齐墩果酸通过调控胰岛素/IGF1信号通路关键基因的转录和翻译延缓Leydig细胞衰老.     

高分辨熔解曲线法检测哈萨克族食管癌患者癌组织中FHIT、CDKN2A启动子区甲基化水平及临床意义

 建立高分辨熔解曲线法(HRM)定量检测哈萨克族食管癌患者癌组织中FHIT、CDKN2A甲基化水平,并分析甲基化水平与食管癌病理参数的相关性。选取30例食管癌癌患者癌组织及30例癌旁组织,提取DNA,进行甲基化修饰。将标准品DNA(甲基化DNA与非甲基化DNA相互的掺入)稀释成0,5%,25%,50%,75%,100%甲基化DNA,并进行重复性和灵敏性评价。应用HRM定量检测癌组织及癌旁组织甲基化水平,探讨FHIT、CDKN2A基因启动子区甲基化水平与食管癌发生发展的关系。100%,80%,50%,30%,10%,0甲基化标准品的高分辨率熔解曲线从右向左依次排列,待测基因在标准曲线上的位置即表示其甲基化程度。HRM最低检测限为1%,明显高于MSP结果最低检测限10%。在30例食管癌癌患者癌组织中,检测出存在FHIT甲基化的为36.7%。其中8例甲基化程度为0—5%,3例为5%—10%。CDKN2A甲基化的为100%,其中7例甲基化程度为0—5%,11例为5%—10%,12例为10%—25%。与正常组织比较,抑癌基因的甲基化与癌症的发生无明显相关性。进一步讨论甲基化与食管癌的病理级别以及甲基化与分化程度的关系,二者均无相关性。通过HRM技术成功建立了定量检测哈萨克族食管癌组织中FHIT、CDKN2A甲基化程度的方法,FHIT、CDKN2A基因启动子甲基化与哈萨克族食管癌的发生发展无明显相关性,但多个抑癌基因的甲基化有望成为其早期发生发展的分子指标。     

大鼠高尿酸血症模型的建立

目的建立大鼠高尿酸血症动物模型。方法采用腺嘌呤、腺嘌呤加酵母、腺嘌呤加乙胺丁醇和氧嗪酸钾盐不同剂量口服灌胃,测定实验前后大鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐,并进行组织学病理切片观察。结果氧嗪酸钾尿酸升高平稳,并且对肾损伤不严重。结论用氧嗪酸钾建立大鼠高尿酸血症模型较合适。     

HCV不同基因型对慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的影响

目的探讨干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎患者临床疗效的相关影响因素.方法对110例慢性丙型肝炎患者进行PEG-IFNα-2a 180μg/周联合RBV 800~1200 mg/d的标准治疗,并完成治疗后24周随访,同时分析HCV基因型、HCV-RNA定量对持续病毒学应答(SVR)的影响.应用罗氏试剂检测丙肝病毒定量,应用反转录-套式聚合酶链反应(PT-PCR)法检测HCV基因型.结果在110例进行标准联合治疗、并完成治疗后24周随访的慢性丙型肝炎患者中,68例患者获得SVR.其中,HCV基因1b型感染者SVR率为51.4%(37/72),HCV基因N-1b型感染者SVR率为81.5%(31/38);基线HCV-RNA水平1.0×10~5IU/m L的患者SVR率为71.2%(42/59),基线HCV-RNA水平≥1.0×10~5IU/m L的患者SVR率为50.9%(26/51).结论非1b基因型SVR率高于1b基因型;基线低病毒RNA水平(血清HCV-RNA水平1.0×10~5IU/m L)SVR率高于基线高病毒RNA水平(血清HCV-RNA水平≥1.0×10~5IU/m L).     

高尿酸血症动物模型的建立及应用

为建立高尿酸血症动物模型,以不同剂量腺嘌呤分别饲喂鸡,设别嘌呤醇作为治疗组,监测血尿酸、尿尿酸及肾功能变化,并进行肾组织病理形态学及超微结构观察。结果示中剂量组鸡于实验第三周血尿酸水平升高,且持续稳定升高八周以上,肾超微结构改变不明显。经别嘌呤醇治疗后血到水平降低。中剂量组可作为观察药物治疗作用的高尿酸血症动物模型。     

银川地区尿酸转运相关基因多态性与高尿酸血症相关性研究

目的 分析银川地区居民尿酸水平的影响因素,探讨溶质载体家族30成员3(SLC30A3)基因多态性与高尿酸血症发生的关系.方法 选取高尿酸血症患者614例,同期年龄和性别构成相当的尿酸正常健康体检者600例为对照组.使用Haploview软件筛选SLC30A3基因tagSNP,共得到2个SNP位点(rs13267319,rs24628779),分析SLC30A3基因多态性与银川地区居民高尿酸血症的关系.结果 银川地区居民中男性受试者尿酸水平与BMI值、腰围、收缩压、GLU呈正相关,与HDL-C呈负相关;女性受试者尿酸水平与腰围、GLU、TC、TG呈正相关,与HDL-C呈负相关.多因素Logistic回归分析显示:BMI值、收缩压、舒张压、TG、LDL-C、Cre是高尿酸血症的独立危险因素,HDL-C是高尿酸血症的保护因素.SLC30A3基因rs13267319位点在高尿酸血症组AG型和AA型比例均明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);与GG型相比,AG型和AA型患高尿酸血症的危险性均明显降低;等位基因A相对于G对高尿酸血症有保护作用.SLC30A3基因rs24628779位点在高尿酸血症组CT型和TT型比例均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);与CC型相比,CT型和TT型患高尿酸血症的危险性均明显增高.等位基因C相对于T对高尿酸血症有促进作用.结论 SLC30A3基因rs13267319,rs24628779位点与银川地区居民高尿酸血症的发病机制存在明显关联.     

T—ALL／淋巴瘤中BCL11B基因转录本的分析

目的:分析T-ALL/淋巴瘤中BCL11B基因转录本的特点。方法:利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时定量聚合酶链式反应(RQ-PCR)方法分析12例T-ALL/淋巴瘤外周血单个核细胞(PBMC)中BCL11B基因的表达情况;限制性内切酶消化确定PCR产物的特异性。结果:3例T-ALL/淋巴瘤患者中出现2种BCL11B转录本:野生型和第3外显子缺失型,其余9例均表达第3外显子缺失型的转录本。两组病人PBMC中BCL11B表达水平无显著差别(P=0.301)。结论:3例T-ALL/淋巴瘤病人中存在2种BCL11B基因转录本,但在表达水平上无明显差别。     

辛伐他汀对高胆固醇血症小鼠肝脏基因表达的影响

采用抑制消减杂交方法结合targeted display法分离鉴定辛伐他汀处理高胆固醇血症小鼠后差异表达的基因,并采用定量RTPCR方法对utrophin、TNF-α的mRNA转录水平进行了研究.结果表明辛伐他汀处理后7个基因上调表达,19个基因下调表达;这些基因涉及转录、脂质代谢、免疫反应等过程.定量RT-PCR分析显示utrophin与TNF-α的mRNA转录水平降低.     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术，并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物，将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度，利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好，与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系，方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰；该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比，热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

实时荧光定量PCR检测多鳍鱼Shh基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

为了快速、准确定量多鳍鱼Shh基因在机体组织中的表达水平,根据笔者克隆的Shh基因序列,选择其高度保守区域设计一对引物,对多鳍鱼各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α。筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明Shh基因保守区段已经成功克隆。将重组标准品质粒进行倍比稀释,然后以此为模板,进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。回归方程为y=-0.32x 10.47,回归系数为1.00。构建Shh基因表达检测标准品质粒和标准曲线,建立检测多鳍鱼Shh基因荧光定量PCR方法,为进一步研究Shh基因在组织中的动态分布和研究多鳍鱼系统发育奠定了基础。     

玉柏石松中甾体化合物对体外培养成骨细胞活性的影响

为研究玉柏石松中甾体化合物豆甾烷-3-酮-21-羧酸(SA)对体外培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1活性的影响,用Alamar Blue法检测了成骨细胞增殖率,碱性磷酸酶试剂盒检测了细胞中碱性磷酸酶活性,茜素红染色检测了成骨细胞矿化水平,荧光定量PCR检测了成骨细胞骨分化相关基因的表达.结果显示:8μmol/L和16μmol/L的SA处理细胞8 d能抑制成骨细胞碱性磷酸活性;处理细胞16 d能提高骨细胞矿化水平.SA抑制成骨早期分化相关基因(Runx-2和Osterix)的表达,促进骨基质蛋白OPN和骨重建相关转录因子(Jun-D,Fra-1和Fra-2)的表达.故SA具有促进骨折愈合的成骨活性,可能通过促进相关转录因子表达,骨折断面旧骨的吸收和骨基质钙化等方式完成.     

紫草对重症急性胰腺炎肺损伤的实验研究

目的观察紫草对大鼠重症急性胰腺炎(SAP)肺组织病理变化及血清TNF-α、IL-6和NO的影响。方法选用Wistar大鼠随机分为假手术组(NS组)、模型组(SAP组)、紫草3 g/kg(H-紫草组)和紫草1 g/kg组(L-紫草组),检测术后24 h和72 h肺组织病理变化及血清TNF-α、IL-6和NO水平。结果 H-紫草组和L-紫草组死亡率明显低于SAP组;H-紫草组和L-紫草组NO活性较高与SAP组相比P<0.01;而血清TNF-α和IL-6的含量显著降低,与SAP组比较。肺组织病理变化:SAP组可见肺间质充血、水肿,炎性细胞浸润严重,肺泡腔部分融合成肺大泡。H-紫草组和L-紫草组大鼠肺组织炎症反应明显较模型组减轻。结论紫草能降低SAP大鼠死亡率,提高血清NO活性、降低TNF-α和IL-6含量,减轻SAP所致的肺损伤。     

高校职工高尿酸血症患病状况及相关因素分析

目的:为了了解高校教职工高尿酸血症患病状况,分析高尿酸血症与超重肥胖及血压、血糖、血脂的关系.方法:通过对2016年在民族高校体检的20-90岁1029例(男442例,女587例)人群进行体格检查及血生化检测,男性血尿酸420umol/L,女性360umol/L为高尿酸血症(HUA),统计不同年龄组不同性别高尿酸血症患病率,分析高尿酸血症与超重肥胖相关性以及高尿酸血症与血脂、血糖、血压等不同代谢指标的相关性.结果:(1)该人群高尿酸血症患病率15.45%,男22.85%,女9.88%,男性高尿酸血症患病率高于女性.(2)随着体重指数(BMI)增加,高尿酸血症患病率明显升高.(3)高尿酸血症组比正常尿酸组BMI、血脂、血糖及血压紊乱均高.BMI及甘油三酯(TG)明显升高.结论:高校高尿酸血症患病率高,年龄性别差异影响高尿酸血症,高尿酸血症人群肥胖、血脂异常、高血糖、高血压的发生率明显增加.